Charakterisierung der Na + -abhängigen Phosphataufnahme in BSMV des

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

P hosphatkonzentration (m m oll^-1) Na+ -abhängige Phosphataufnahme (nmol[mg Protein]-1 10 s-1 )

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

P hos pha t-K inetik

Abb. 18: Kinetik und Scatchard plot der kalkulierten, spezifischen Na⁺-abhängigen Phosphataufnahme in BSMV des mittleren Jejunums von Ziegenlämmern bei unterschiedlicher Proteinversorgung.

Großes Bild: Kurvenverläufe der kalkulierten, Na⁺-abhängigen Phosphataufnahme in Abhängigkeit von der Proteinversorgung.

Kleines Bild: Scatchard plot (V gegen V/S (Phosphatkonzentration)).

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD pro Phosphatkonzentration und Fütterungs-gruppe; n = 8; ■CAS = Casein, ●SP = Sojaprotein, ▲SPAA = Sojaprotein + Aminosäurenmix.

Die durchschnittlichen kinetischen Parameter des Na⁺-abhängigen Phosphattransports für die drei Fütterungsgruppen wurden aus den Mittelwerten der Einzeltierwerte für Vmax und Km

errechnet (Abb. 19). Die maximale Transportrate (Vmax) von Phosphat lag bei einer Inkubationszeit von 10 s mit 0,26 ± 0,1 nmol·[mg Protein]^-1 für die Kontrollgruppe CAS und 0,25 ± 0,13 nmol·[mg Protein]^-1 für die Versuchsgruppe SP etwas niedriger als in der

Versuchsgruppe SPAA. In dieser Gruppe wurde eine tendenziell höhere Aufnahmerate von 0,35 ± 0,13 nmol·[mg Protein]^-1 ermittelt.

Die halbmaximale Sättigung (Km) wurde in allen drei Fütterungsgruppen bei einer nahezu identischen Phosphatkonzentration im Inkubationsmedium erreicht. Sie betrug in der CAS-Gruppe 0,06 ± 0,05 mmol·l^-1, in der SP-Gruppe 0,08 ± 0,05 mmol·l^-1 und in der

Abb. 19: Kinetische Parameter (Vmax und Km) des Na⁺-abhängigen Phosphattransports in BSMV des mittleren Jejunums von Ziegenlämmern in Abhängigkeit der Fütterung.

Abgebildet sind die Mittelwerte ± SD; n = 8; Signifikanzanalyse durch One-way ANOVA und Tukey`s post test: nicht signifikant; CAS = Casein, SP = Sojaprotein, SPAA = Sojaprotein + Aminosäurenmix.

durchgeführten Scatchard plot ließ sich abschätzen, ob ein weiteres Transportsystem an der H⁺-abhängigen Peptidaufnahme beteiligt war (Abb. 20, kleines Bild).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gly- Sar- Konzentration (mmoll^-1) H+ -abhängige Gly-Sar-Aufnahme (nmol[mg Protein]-1 10 s-1 )

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Abb. 20: Kinetik und Scatchard plot der kalkulierten, spezifischen H⁺-abhängigen Peptidaufnahme (Gly-Sar) in BSMV des distalen Jejunums von Ziegenlämmern bei unterschiedlicher Proteinversorgung.

Großes Bild: Kurvenverläufe der kalkulierten, H⁺-abhängigen Peptidaufnahme in Abhängigkeit von der Proteinversorgung.

Kleines Bild: Scatchard plot (V versus V/S (Gly-Sar-Konzentration)).

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD pro Gly-Sar-Konzentration und Fütterungsgruppe; n = 8; ■CAS = Casein, ●SP = Sojaprotein, ▲SPAA = Sojaprotein + Aminosäurenmix.

Um die durchschnittlichen kinetischen Parameter für die gesamte Fütterungsgruppe zu erhalten, wurde der Mittelwert der berechneten Einzeltierwerte gebildet und die Standardabweichung angegeben (Abb. 21). Die maximale Aufnahme von Gly-Sar, als Maß der Transportkapazität, wurde durch den teilweisen Ersatz von Casein durch Sojaprotein im

-1 -1

Casein gefütterten Tieren (CAS-Kontrollgruppe 1,52 ± 0,49 nmol·[mg Protein]^-1·10 s^-1) nicht beeinflusst. Die zusätzliche Gabe einzelner freier Aminosäuren zu dem Sojaprotein (SPAA-Gruppe) führte jedoch anscheinend zu einer Stimulation der Gly-Sar-Aufnahme, die Transportkapazität war im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen signifikant erhöht (2,27

± 0,36 nmol·[mg Protein]^-1·10 s^-1). Die halbmaximale Sättigung als Maß für die Substrat-affinität wurde durch die unterschiedliche Proteinversorgung nicht signifikant verändert und lag bei 3,14 ± 1,32 mmol·l^-1 (CAS), 3,04 ± 1,19 mmol·l^-1 (SP) bzw. 2,54 ± 0,47 mmol·l^-1

Abb. 21: Kinetische Parameter (Vmax und Km) des spezifischen H⁺-abhängigen Trans-ports von Glycylsarcosin (Gly-Sar) in BSMV des distalen Jejunums von Ziegenlämmern in Abhängigkeit der Fütterung.

Abgebildet sind die Mittelwerte ± SD; n = 8; Signifikanzanalyse über One-way

4. Diskussion

4.1

Beurteilung der angewandten Methoden

4.1.1 Tiere

Der Fütterungsversuch wurde im Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) in Dummerstorf durchgeführt. So war sichergestellt, dass eine fachmännische Betreuung der Tiere unter etablierten Haltungsbedingungen und kontrollierten Fütterungsregimen erfolgte. Es wurden nur Rassetiere aus demselben Zuchtbestand und ausschließlich männliche Ziegenlämmer gleichen Alters verwendet. Diese Auswahl ermöglichte ein weitestgehend einheitliches Tiermaterial und garantierte standardisierte Rahmenbedingungen. Die Aufstallung der Tiere erfolgte praxisnah in Großraumboxen auf Spaltenboden und entsprach den aktuellen Tierschutzbestimmungen. Einem durch Langeweile der Tiere ausgelösten unphysiologischen Verhalten, wie gegenseitiges Belecken und Beknabbern, wurde durch Stroh- und Heugaben und auch durch Spielzeug entgegengewirkt. Die Tiere zeigten weder Auffälligkeiten im Verhalten noch im Gesundheitszustand. Allerdings verstarb ein Tier der Casein-Gruppe kurz nach der Aufstallung an Diarrhoe ungeklärter Genese und wurde durch ein anderes Tier aus dem gleichen Zuchtbestand ersetzt.

4.1.2 Fütterungsmodell

Aus früheren Studien und auch aus der landwirtschaftlichen Praxis ist bekannt, dass eine Fütterung von Milchlämmern mit Milchaustauschern, die zu einem hohen Prozentsatz Sojaproteinprodukte enthalten, zu einer Beeinträchtigung der Dünndarmfunktion beim jungen Wiederkäuer führen kann. Die Folgen sind Wachstumsstörungen und schlechterer Gesundheitszustand, der sich in Form von milden bis starken Diarrhoen äußert. Bei

ungünstigem Krankheitsverlauf oder allgemeiner Anfälligkeit der Tiere können sich daraus Sekundärerkrankungen entwickeln, was im schlimmsten Fall sogar den Tod der Lämmer bedeuten kann. Zu sehen sind morphologische Veränderungen am Darmepithel, die sich als Zottenatrophie, Verlust der Integrität der Zotten und allergische Reaktionen der Darmmucosa darstellen (KILSHAW u. SISSONS 1979, SEEGRABER u. MORRILL 1979). Sojaprotein konnte bei Kälbern außerdem membranständige Enzyme des Jejunums wie alkalische Phosphatase, Lactase und Aminopeptidase N hemmen (MONTAGNE et al. 1999) und den Transport von Xylose bei Kälbern (SEEGRABER u. MORRILL 1986, LALLES et al. 1995) sowie von Glucose bei Ferkeln (BOUDRY et al. 2003) beeinträchtigen.

In früheren Versuchen (durchgeführt im FBN Dummerstorf) mit einem Milchaustauscher, der nur 35 % Sojaprotein enthielt und mit 7 gegenüber Casein defizienten Aminosäuren (Thr, Val, Ile, Leu, His, Lys und Met) ergänzt wurde, ließen sich ebenfalls geringe strukturelle Veränderungen am Darmepithel im Vergleich zu einer Casein-gefütterten Kontrollgruppe feststellen (Villushöhe/Kryptentiefe im proximalen Jejunum war bei Casein höher). Diese wirkten sich allerdings nicht negativ auf Wachstum und Entwicklung aus (SCHÖNHUSEN et al. 2007).

Zusätzlich am Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführte molekularbiologische und funktionelle Untersuchungen (HUBER 2004, unveröffentlicht) im Rahmen des oben genannten Vorversuches zeigten, dass die Fütterung von Sojaprotein einen Einfluss auf Nährstofftransportsysteme des Jejunums beim Ziegenlamm hatte. Phosphat- und Glucoseaufnahmestudien in BSMV dieser Ziegenlämmer zeigten, dass die Transportkapazität jeweils nicht verändert war, die Affinität des Transportes für Phosphat war in der Sojagruppe jedoch tendenziell erniedrigt und die Transporteraffinität für Glucose erhöht. Die gemessenen Werte waren auf Grund der hohen Streuung jedoch nicht

vorliegenden Arbeit der Anteil des Sojaproteins auf 50 % angehoben mit dem Ziel, auftretende Effekte verstärken zu können. Außerdem wurden in der SPAA-Gruppe alle im Sojaprotein defizitären Aminosäuren an die Gehalte im Casein angepasst. Hypothetisch konnte so nur noch die Proteinstruktur des Sojaproteins selbst einen Einfluss auf die Darmmucosa haben.

Das in diesem 50 %-Versuch verwendete Sojaproteinisolat SUPRO-901 war ein qualitativ hochwertiges Produkt und zeichnete sich laut Hersteller durch besonders geringe Gehalte an Trypsininhibitoren, Isoflavonen und antigenen Komponenten aus. Es wurde gezielt ein allgemein gebräuchliches und frei verkäufliches Produkt gewählt, um Praxisnähe herzustellen und im Anschluss an die durchgeführten Untersuchungen gegebenenfalls geeignete Fütterungsempfehlungen zur Verbesserung der Tiergesundheit auszusprechen.

Die Energie- und Proteingehalte der isonitrogenen und isokalorischen Diäten wurden so gewählt, dass sie eine adäquate Versorgung der Ziegenlämmer gewährleisten konnten (0,4 MJ ME und 7 g Rp). Die Empfehlungen für eine adäquate Energie- und Proteinversorgung präruminierender, milchgefütterter Ziegenlämmer bis zu einem Lebendgewicht von 15 kg liegen laut der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie (GfE 2003) bei 0,39 - 0,49 MJ ME·[kg KGW·Tag]^-1 und 4,5 - 8 g Rp·[kg KGW·Tag]^-1 (in Abhängigkeit von Lebendmasse und erwünschter täglicher Zunahme). Die Ziegenlämmer erhielten ihre Milchtränken über separate Flaschenfütterung, damit die Aufnahmen optimal kontrolliert werden konnten. Bis zum Versuchsende im Alter von 9 Wochen wurde so die Milchfütterung über die normale Absetzzeit hinaus erhalten. Physiologisch erfolgt eine Festfutteraufnahme schon in der ersten Lebenswoche und die Entwicklung des Vormagensystems beginnt mit steigenden Raufutteraufnahmen ab der 2. - 3. Woche (KAY 1960). Durch die ausschließliche Milchfütterung jedoch kann die Vormagenentwicklung von Lämmern verzögert werden (LANE et al. 2000, SWAN u. GROENEWALD 2000). Diese Art der Fütterung ermöglichte es zum einen, den langfristigen Effekt von Sojaprotein auf Transportsysteme des Jejunums in einer entscheidenden Phase der Darmentwicklung optimal zu untersuchen. Eine Beeinflussung der Verdauung und des Nährstofftransports im Jejunum durch die beginnende Vormagenentwicklung und der damit verbundenen Ab- und Umbauvorgänge der Nährstoffe durch die Mikroorganismen des Vormagensystems wurde so weitestgehend vermieden. Zum

anderen wurde hierdurch der Bezug zur landwirtschaftlichen Praxis geschaffen, in der eine verlängerte Milchaufzucht in der Jungtiermast üblich ist.

Um die fütterungsexperimentellen Bedingungen trotzdem tierartgerecht zu halten, wurden, wie bereits erwähnt, geringe Mengen an Heu und Stroh gegeben, so dass die Entwicklung der Vormägen nicht vollständig unterdrückt, aber verlangsamt wurde. Um den Entwicklungs-status des Vormagens beurteilen zu können, wurden daher bei der Schlachtung Pansen und Labmagen hinsichtlich Größe, Schleimhautoberfläche und Ingesta untersucht. Bei allen Tieren war der Pansen kleiner als physiologisch der Altersstufe entsprechend zu erwarten gewesen wäre, der Labmagen dagegen sehr groß (etwa 1:3-4). Die Pansenzotten waren kaum ausgebildet und es befand sich nur in Spuren Ingesta im Pansen, so dass von einem noch vollständigen Schluss der Schlundrinne ausgegangen werden konnte. Der Labmagen war gefüllt mit koagulierten Milchbrocken, welche bis in den Darm hinein zu finden waren. Die Befunde deuteten darauf hin, dass das Vormagensystem, wie erwünscht, noch unausgereift war.

Die 6 - 7-wöchige Fütterung der unterschiedlichen Diäten führte im Vergleich zur Kontrollgruppe zu keiner signifikanten negativen Beeinträchtigung der Gewichtsentwicklung der Ziegenlämmer. Zwar konnte die alleinige Zugabe von Glutamin nicht die bei Kälbern durch anteilige Sojaproteinfütterung entstandene Wachstumsdepression vermindern (DRACKLEY et al. 2006), so dass deutlich wird, dass die alleinige Supplementation einer einzelnen Aminosäure nicht ausreichend ist. KANJANAPRUTHIPONG (1998) konnte jedoch bei Kälbern schon mit Zugabe von drei essentiellen Aminosäuren zu einem Milchaustauscher, der 40 % Sojaprotein enthielt, eine deutliche Verbesserung der Verdaulichkeit von Trockensubstanz, Stickstoff und Aminosäuren erzielen und so die

Dass in der vorliegenden Studie auch in der SP-Gruppe keine messbare Beeinflussung der Gewichtsentwicklung auftrat, obwohl die Fütterung von verschiedenen Sojaproteinprodukten in anderen Studien dazu führte, kann z.T. mit der Reinheit und der weiterentwickelten Verarbeitung von modernen, isolierten Sojaproteinen erklärt werden, die in ihrer antigenen Wirkung und ihrem Anteil an sekundären Inhaltsstoffen stark reduziert wurden (LALLES et al. 1995). Ein solches Präparat wurde in dieser Studie verwendet. Starke Veränderungen wurden hauptsächlich bei älteren, unverarbeiteten Sojaprodukten (Mehle, Konzentrate) beobachtet, während durch hoch aufgereinigte und verarbeitete Sojaproteinisolate (hypoallergen) die negativen Effekte minimiert wurden. Unterschiedlich beobachtete Effekte beruhen aber unter anderem auch auf verschiedenartig gewählten Diätparametern (Anteil Sojaprotein, verwendetes Produkt: unverarbeitet, verarbeitet, hydrolysiert, hypoallergen etc., Dauer der Diät), verschiedenen Tierarten oder Rassen, unterschiedlichem Alter der Tiere (je jünger, desto heftiger die Reaktion) und Adaption der Tiere an die unterschiedlichen Diäten in den Experimenten.

Dennoch werden in der Praxis auch fortschrittliche Sojaprodukte oft noch für auftretende Durchfallgeschehen verantwortlich gemacht. Trotz ungestörter Gewichtsentwicklung der Tiere wurden negative Effekte, wie z.B. Hemmung des Glucosetransports bei Schweinen oder höhere ileale Proteinverluste beobachtet (MONTAGNE et al. 1999, 2003, BOUDRY et al.

2003).

4.1.3 Beeinflussung der Zottenstruktur des Jejunums von Ziegenlämmern bei unterschiedlicher Proteinversorgung

Auch die Veränderung der Zottenstruktur könnte ursächlich an einer Störung der Funktion der Mucosa beteiligt sein. Die Dünndarmzotten der Ziegenlämmer aus der vorliegenden Studie wiesen deutliche strukturelle Unterschiede auf, die aber nicht quantitativ erfasst wurden. Die Zotten der SP-Gruppe waren unregelmäßig, stumpfer und kürzer als die der anderen Gruppen.

Im Vergleich dazu waren die Zotten in der SPAA-Gruppe weniger stark verändert. Sie erschienen nur leicht verkürzt, integer und gleichmäßig. Es scheint, als könnte eine Supplementation aller essentiellen Aminosäuren vor starken Veränderungen im

Diese Beobachtung bestätigte andere Untersuchungen des Jejunumepithels unter Casein-fütterung, die zu langen, abgerundeten und intakten Zotten führte, während unter Sojaproteinfütterung unregelmäßige und zum Teil zerstörte Zotten zu sehen waren (SEEGRABER u. MORRILL 1982, KILSHAW u. SLADE 1982, SILVA et al. 1986). Die Villushöhe wurde durch Sojaprotein gegenüber Casein-gefütterten Tieren signifikant verringert (SCHÖNHUSEN et al. 2004, DRACKLEY et al. 2006).

Dies wurde aber im Rahmen der vorliegenden Studie nicht histometrisch quantifiziert, sondern nur als qualitative Beobachtung erfasst. Die exakte histometrische Vermessung der Zottenstruktur ist ein weiterer Bestandteil dieses gemeinsamen DFG-Projektes und wird von einer anderen beteiligten Arbeitsgruppe durchgeführt.

CAS SP SPAA

Abb. 22: Beeinflussung der Zottenausbildung des Jejunums von Ziegenlämmern durch unterschiedliche Proteinquellen im Milchaustauscher (HE-Färbung, 10-fache Vergrößerung; Färbung B. Leppich).

Es wurde beispielhaft das Darmepithel eines Tieres jeder Gruppe gezeigt (CAS =

Lange dünne,

gleichförmige Zotten Ungleichmäßige Gestalt, zerstörte Strukturen, stark

verkürzte Zotten

Gleichmäßige, leicht verkürzte und verdickte

Zotten

4.1.4 Phosphat und Gesamtproteinmenge im Blutplasma von Ziegenlämmern bei unterschiedlicher Proteinversorgung

Die Phosphatkonzentration im Blutplasma war durch die unterschiedliche Proteinversorgung nicht beeinflusst. Dies war auch nicht zu erwarten, da die intestinale Phosphataufnahme, welche Einfluss auf den Plasma-Pi-Spiegel haben könnte, in beiden Sojaprotein-Gruppen nicht verändert war. Die Werte lagen mit 2,78 - 2,86 mmol·l^-1 innerhalb des physiologischen Bereichs, in der Literatur werden für Ziegen Werte von 1,0 - 3,4 mmol·l^-1 angegeben (KOLB 1989, APFEL 1994).

Die im Plasma gemessene Gesamtproteinmenge (Versuchsende, einen Tag vor Schlachtung, 3h nach Morgenfütterung) als Ausdruck der Syntheseleistung des Leberstoffwechsels deutete jedoch auf eine Beeinflussung durch die unterschiedliche Proteinversorgung hin. Sie war, im Vergleich zur Kontrollgruppe (56 mg·ml^-1), in der SPAA-Gruppe signifikant erniedrigt (52 mg·ml^-1; p < 0,01). Wie und warum die Gesamtproteinmenge im Blutplasma verändert wurde, ist unklar. Da die Gesamtproteinmenge durch das Zusammenwirken zahlreicher Stoffwechselvorgäne beeinflusst wird (Immunstatus, Leberstoffwechsel etc.), kann nicht mit Sicherheit geklärt werden, ob die relative Erniedrigung der Gesamtproteinmenge ein Effekt der Aminosäurensubstitution war, zumal die Werte statistisch gesehen zwar signifikant unterschiedlich waren, sich aber insgesamt im Rahmen der physiologischen Schwankungs-breite der Plasmaproteinkonzentrationen bei milchernährten Ziegenlämmern befand (49 - 60 mg·ml^-1, SANZ SAMPELAYO et al. 1998).

Möglicherweise waren einige der in der SPAA-Gruppe zugesetzten Aminosäuren (z.B.

Glycin) als Proteine an Reparaturmechanismen (Zellerneuerung o.ä.) der intestinalen Mucosa beteiligt (SCHÖNHUSEN et al. 2007), so dass trotz der gegenüber Casein gleichen Gehalte an Aminosäuren ein Teil der zugeführten Aminosäuren verbraucht wurde, um die durch das enthaltene Sojaprotein entstandenen Epithelschäden zu kompensieren. Da diese in der reinen Sojagruppe nicht substituiert waren, konnten sie auch nicht für Reparaturmechanismen o.ä.

vermehrt verbraucht werden oder als Signal-Aminosäuren die Erneuerung der Mucosa anregen. Auf der anderen Seite hatten verschiedene Aminosäuren (z.B. Threonin) in Kombination mit Sojaprotein eine geringere ileale Verdaulichkeit (KANJANAPRUTHIPONG 1998). Auch spielt die Tatsache eine Rolle, dass ein Teil der

Aminosäurengehalte in der SPAA-Gruppe in freier Form vorlagen, was sie im Vergleich zu proteingebundenen Aminosäuren anfälliger für Oxidation machte (METGES et al. 2000).

KUHLA et al. (2007) fanden im Rahmen des oben erwähnten Versuches mit 35 % Sojaproteinanteil im Milchaustauscher heraus, dass bei 5 von 20 Aminosäuren unterschiedliche Plasmakonzentrationen messbar waren, obwohl dem Sojaprotein 7 essentielle und dem Casein gegenüber defizitäre Aminosäuren zugesetzt wurden, um sie an die Gehalte des Caseins anzugleichen. Serin und Prolin waren im Plasma erniedrigt und korrelierten mit den Gehalten in der Diät. Glycin war ebenfalls erniedrigt, obwohl höhere Gehalte im Sojaprotein vorlagen. Da Serin ein Baustein des Glycins ist, kann der niedrigerere Gehalt des Serins zu herabgesetzten Aufbauraten des Glycins geführt haben. Möglicherweise war es aber auch an der de novo-Nucleotid-Biosynthese der intestinalen Mucosa beteiligt.

Threonin war im Plasma ebenfalls erniedrigt, obwohl die Aufnahme über die Diät dem Casein gegenüber vergleichbar war. Dies kann an der geringeren ilealen Verdaulichkeit von Threonin in Kombination mit Sojaprotein liegen, oder daran, dass das Threonin in freier Form vorlag.

Freie Aminosäuren können leichter oxidieren als proteingebundene. Phenylalanin war dagegen trotz gleicher Zufuhr im Plasma erhöht, vielleicht wird diese Aminosäure in freier Form leichter absorbiert und/oder geht nicht durch den verstärkten Ingesta-Flow mit dem Sojaprotein verloren.

KUHLA et al. (2007) konnten außerdem zusätzlich zu morphologischen Veränderungen in der Mucosa (Kryptentiefe verkürzt; Villus:Krypten-Verhältnis erhöht) differente Proteinmuster im Jejunum bei Soja-gefütterten Ziegen darstellen. Von 131 identifizierten Proteinen wurden im Vergleich zur Casein-gefütterten Kontrollgruppe 32 Proteine unterschiedlich exprimiert. Die herunterregulierten Proteine standen im Jejunum unter anderem im Zusammenhang mit der Generierung des Zytoskeletts, was zu Funktionsverlusten

4.1.5 Aufnahmestudien in isolierte BSMV mittels Schnell-filtrationstechnik

Die Messungen der intestinalen Substrataufnahmen bei Ziegenlämmern zur Untersuchung des Einflusses der Proteinquelle auf Transportvorgänge wurden an isolierten Bürstensaum-membranvesikeln durchgeführt. Der erste, in der Regel geschwindigkeitsbestimmende und regulierte Schritt des transepithelialen Transportes, die Substrataufnahme über die apikale Membran, kann mit dieser Methode bestimmt werden. Da jegliche intrazellulären Strukturen, Kompartimente und Proteine bei dieser in vitro-Methode durch den Präparationsvorgang abgetrennt werden, sind Substrataufnahmestudien in BSMV dazu geeignet, diese Transportprozesse an der apikalen Membran selektiv zu untersuchen, ohne dabei den Einfluss zellulärer Stoffwechselprozesse oder second-messenger-Systeme zu berücksichtigen (MURER u. KINNE 1980). Die untersuchten Nährstofftransportvorgänge können so isoliert charakterisiert und fütterungsbedingte Einflüsse registriert werden, sofern sie über die Expressionshöhe der Transportsysteme oder Veränderungen ihrer kinetischen Eigenschaften mediiert werden. Durch die Trennung von Intra- und Extravesikulärraum können außerdem die Transportbedingungen über individuelle Pufferzusammensetzung (Vesikelfüllpuffer, Inkubationsmedium, Stopp-Lösung) an den entsprechenden Versuchsaufbau angepasst, variiert und kontrolliert werden.

Dabei muss allerdings beachtet werden, dass diese Methode eine vollkommen artifizielle Umgebung schafft und somit nicht unbedingt die tatsächlichen Reaktionen und Anpassungen des Epithels in vivo wiedergeben kann (MURER u. KINNE 1980). Die Ergebnisse aus solchen Studien sollten demnach immer im Kontext mit anderen gleichartigen Versuchen an intaktem Gewebe (z.B. Ussing, Everted-Loops etc.) beurteilt werden. Da es aber das Ziel dieser Arbeit war, den Transport von Glucose, Phosphat und Peptiden (Glycylsarcosin) über die jejunale Bürstensaummembran zu charakterisieren, stellte die Vesikeltechnik die Methode der Wahl dar.

Die angewandte Mg²⁺-EGTA-Präzipitationsmethode zur Präparation von BSMV verschie-dener Spezies ist seit langem etabliert (Niere: BOOTH u. KENNY 1974, BIBER et al. 1981, HILDEN et al. 1989, Darm: KAUNE et al. 1992, STEIN et al. 1994). Die Funktionalität und Nutzbarkeit (Oberfläche, Stabilität) der so gewonnenen BSMV zur Messung von

Stofftransporten über apikale Membranen wurde mehrfach erforscht und erwiesen (KESSLER et al. 1978, HOPFER 1989).

Die Eignung der Präparationsmethode speziell für Ziegendärme konnte darüber hinaus durch frühere Transportstudien mittels Schnellfiltrationstechnik (GÄRTNER 1993, RÜBELT 1995), unter anderem durchgeführt am Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover (WALTER 1999, ROESLER 2002, HATTENDORF 2004), bestätigt werden. So gibt es Daten aus erfolgreichen Untersuchungen zum Phosphattransport in jejunale BSMV von Ziegen (RÜBELT 1995, SCHRÖDER u. BREVES 1996, HUBER et al. 2002, 2007b, HATTENDORF 2004, MUSCHER et al. 2008). Die Aufnahme von Glucose in jejunale BSMV wurde bei Rind und Schaf beschrieben (KAUNITZ u. WRIGHT 1984, WOLFFRAM et al. 1986, MABJEESH et al. 2003) und der Transport von Peptiden (Glycylsarcosin) in BSMV von Jejunum und Ileum bei Milchkühen (WOLFFRAM et al. 1998).

Die Qualität der Präparation der jejunalen BSMV wurde zusätzlich durch die Anreicherung spezifischer Marker- oder Leitenzyme überprüft (MURER u. KINNE 1980). Die alkalische Phosphatase, als Leitenzym der apikalen Membran, wurde im Mittel 10-fach angereichert.

Dies war vergleichbar mit den Ergebnissen aus anderen Untersuchungen an Ziegen (RÜBELT 1995, ROESLER 2002, HATTENDORF 2004), sowie weiteren Spezies (Ratte: BIBER et al.

1981, Schaf und Schwein: WOLFFRAM et al. 1986, Schwein: KAUNE et al. 1992), und bestätigt einen hohen Reinheitsgrad der Präparation. Die Anreicherung der Na⁺/K⁺-ATPase als Leitenzym basolateraler Membrananteile dagegen erfolgte durchschnittlich nur 2-fach, so dass von einer nicht nennenswerten Verunreinigung mit basolateralen Membranen ausgegangen werden kann. Entscheidend ist eine deutlich höhere Anreicherung der Bürstensaummembran gegenüber der basolateralen Membranfraktion, wie es in dieser Arbeit vorlag. Allgemein wurden für die Anreicherung der basolateralen Membranen 2 - 4-fache

stichprobenartig durch Na⁺-abhängige Glucose- bzw. Phosphataufnahmen als Funktion der Zeit überprüft. Im Allgemeinen wird die funktionelle Integrität von BSMV durch Na⁺ -abhängige Glucoseaufnahmen in die BSMV überprüft (HOPFER et al. 1973, NAKAGAWA et al. 1991). Prinzipiell kann der Nachweis aber auch durch andere Substrate (z.B. Phosphat) erfolgen, die aktiv, in diesem Fall über Na⁺-gekoppelte Transportmechanismen, resorbiert werden. Daher wurde die funktionelle Integrität der BSMV in dieser Arbeit auch durch ebenfalls gebräuchliche Na⁺-abhängige Phosphataufnahmen (WALTER 1999, SCHRÖDER et al. 2000, ROESLER 2002) überprüft. In Anwesenheit von Na⁺ wurde bei allen

stichprobenartig durch Na⁺-abhängige Glucose- bzw. Phosphataufnahmen als Funktion der Zeit überprüft. Im Allgemeinen wird die funktionelle Integrität von BSMV durch Na⁺ -abhängige Glucoseaufnahmen in die BSMV überprüft (HOPFER et al. 1973, NAKAGAWA et al. 1991). Prinzipiell kann der Nachweis aber auch durch andere Substrate (z.B. Phosphat) erfolgen, die aktiv, in diesem Fall über Na⁺-gekoppelte Transportmechanismen, resorbiert werden. Daher wurde die funktionelle Integrität der BSMV in dieser Arbeit auch durch ebenfalls gebräuchliche Na⁺-abhängige Phosphataufnahmen (WALTER 1999, SCHRÖDER et al. 2000, ROESLER 2002) überprüft. In Anwesenheit von Na⁺ wurde bei allen

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