Einfluss der Proteinquelle im Milchaustauscher auf die Funktion der Nährstofftransporter im Jejunum von Ziegenlämmern

Einfluss der Proteinquelle im Milchaustauscher auf die Funktion der Nährstofftransporter im Jejunum von

Ziegenlämmern

INAUGURAL ─ DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

─ Doctor medicinae veterinariae ─ ( Dr. med. vet. )

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Korinna Huber Physiologisches Institut

Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. Korinna Huber 2. Gutachter: Prof. Dr. Marcus Pröpsting

Tag der mündlichen Prüfung: 06. März 2009

Gefördert mit Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft

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(Unbekannt)

Für Mama

und meine Familie

Inhalt

Abkürzungsverzeichnis VII Abbildungsverzeichnis X Tabellenverzeichnis XIII

1. Einleitung ...1

1.1 Bedeutung des Dünndarmepithels und bestimmter Transportsysteme für den milchernährten Wiederkäuer ... 1

1.1.1 Mechanismen des Na⁺-abhängigen Glucosetransports ... 3

1.1.2 Mechanismen des Na⁺-abhängigen Pi-Transports ... 5

1.1.3 Mechanismen des H⁺-abhängigen Peptidtransports... 8

1.2 Die Bedeutung von Soja in der Tierernährung... 11

1.3 Inhaltsstoffe der Sojabohne ... 12

1.4 Gewinnung und Aufwertung von Sojaprotein ... 15

1.5 Wirkung des Sojaproteins auf den Intestinaltrakt ... 17

2. Material und Methoden ...23

2.1 Versuchstiere und Haltung ... 23

2.1.1 Fütterung ... 23

2.2 Probenentnahme ... 27

2.3 Chemische Analysen ... 28

2.3.1 Anorganisches Phosphat ... 28

2.3.1.1 Prinzip... 28

2.3.1.2 Durchführung... 28

2.3.2 Gesamtprotein ... 29

2.4 Präparation von Bürstensaummembranvesikeln (BSMV) ... 30

2.4.1 Prinzip ... 30

2.4.2 Präparation ... 30

2.5 Qualitätskontrolle der BSMV-Präparation... 34

2.5.1 Bestimmung der Proteinkonzentration ... 34

2.5.1.1 Prinzip... 34

2.5.1.2 Durchführung... 34

2.5.2 Messung der Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) ... 35

2.5.2.1 Prinzip... 35

2.5.2.2 Durchführung... 36

2.5.3 Messung der Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase ... 38

2.5.3.1 Prinzip... 38

2.5.3.2 Durchführung... 38

2.5.4 Funktionelle Überprüfung der Vesikelintegrität... 39

2.6 Messung der Substrataufnahme in BSMV ... 40

2.6.1 Schnellfiltrationstechnik ... 40

2.6.1.1 Prinzip... 40

2.6.1.2 Durchführung... 41

2.6.2 Berechnung der Substrataufnahme ... 42 2.6.2.1 Transportrate... 42 2.6.2.2 Kinetische Parameter... 42 2.6.3 Versuchsansatz zur konzentrationsabhängigen Glucoseaufnahme in BSMV

des proximalen Jejunums... 44 2.6.4 Versuchsansatz zur konzentrationsabhängigen Phosphataufnahme in BSMV

des mittleren Jejunums... 44 2.6.5 Versuchsansatz zur konzentrationsabhängigen Peptidaufnahme in BSMV

des distalen Jejunums... 45 2.6.6 Versuchsansatz zur zeitabhängigen Glucoseaufnahme in BSMV des

proximalen und distalen Jejunums... 45 2.6.6.1 „Overshoot“ ... 45 2.6.6.2 Linearität der initialen Na⁺-abhängigen Glucoseaufnahme... 46 2.6.7 Versuchsansatz zur zeitabhängigen Phosphataufnahme in BSMV des

mittleren Jejunums ... 46 2.6.7.1 „Overshoot“ ... 46 2.6.7.2 Linearität der initialen Na⁺-abhängigen Phosphataufnahme ... 47 2.6.8 Versuchsansatz zur zeitabhängigen Peptidaufnahme in BSMV des distalen

Jejunums ... 47 2.6.8.1 „Overshoot“ ... 47 2.6.8.2 Linearität der initialen H⁺-abhängigen Peptidaufnahme ... 47 2.6.9 Versuchsansatz zur Hemmung des Na⁺-unabhängigen Transports mit

Phloretin: „Zusatzversuch Hemmung GLUT2“... 47 2.7 Chemikalien... 49 2.8 Statistik ... 50

3.2 Charakterisierung der BSMV ... 53

3.2.1 Anreicherung der Bürstensaummembranfraktion... 53

3.2.2 Integrität der BSMV ... 55

3.2.2.1 Zeitabhängige Glucoseaufnahme in BSMV des proximalen und distalen Jejunums... 55

3.2.2.2 Zeitabhängige Phosphataufnahme in BSMV des mittleren Jejunums ... 56

3.3 Funktionelle Untersuchungen... 58

3.3.1 Charakterisierung der Glucose-, Phosphat und Peptidaufnahme in BSMV des Jejunums ... 58

3.3.1.1 Linearität der initialen Na⁺-abhängigen Glucose- bzw. Phosphataufnahme... 58

3.3.1.2 Linearität der initialen H⁺-abhängigen Peptidaufnahme ... 59

3.3.1.3 Konzentrationsabhängige Substrataufnahmen in BSMV des Jejunums ... 59

3.3.2 Charakterisierung der Na⁺-abhängigen Glucoseaufnahme in BSMV des proximalen Jejunums von Ziegenlämmern... 61

3.3.2.1 Hemmung des Na⁺-unabhängigen Transports mit Phloretin: Zusatzversuch „Hemmung GLUT2“ ... 64

3.3.3 Charakterisierung der Na⁺-abhängigen Phosphataufnahme in BSMV des mittleren Jejunums von Ziegenlämmern... 65

3.3.4 Charakterisierung der H⁺-abhängigen Peptidaufnahme (Gly-Sar) in BSMV des distalen Jejunums bei Ziegenlämmern ... 67

4. Diskussion...70

4.1 Beurteilung der angewandten Methoden... 70

4.1.1 Tiere ... 70

4.1.2 Fütterungsmodell ... 70

4.1.3 Beeinflussung der Zottenstruktur des Jejunums von Ziegenlämmern bei unterschiedlicher Proteinversorgung ... 74

4.1.4 Phosphat und Gesamtproteinmenge im Blutplasma von Ziegenlämmern bei unterschiedlicher Proteinversorgung ... 76

4.1.5 Aufnahmestudien in isolierte BSMV mittels Schnellfiltrationstechnik... 78

4.1.6 Messung der Substrataufnahmen (Glucose, Phosphat, Peptid) in jejunale BSMV von Ziegenlämmern... 81

4.1.6.1 Glucosetransport und -transporter ... 81

4.1.6.2 Phosphattransport und -transporter... 86

4.1.6.3 Peptidtransport und -transporter ... 87

4.1.7 Charakterisierung der Nährstofftransporte ... 90

4.1.7.1 Kinetische Parameter des Glucosetransports... 90

4.1.7.2 Kinetische Parameter des Phosphattransports ... 91

4.1.7.3 Kinetische Parameter des Peptidtransports (Glycylsarcosin)... 91

4.2 Einfluss von Sojaprotein auf den Transport von Glucose über die apikale Membran des Jejunums bei Ziegenlämmern... 94

4.2.1 Einfluss von Sojaprotein und/oder seinen Inhaltsstoffen auf den Mucosa- aufbau... 95

4.2.2 Einfluss von Sojaprotein und/oder seinen Inhaltsstoffen auf Membraneigenschaften und den Elektrolythaushalt... 96

4.2.3 Einfluss von Sojaprotein und/oder seinen Inhaltsstoffen auf Verdauungs- enzyme ... 98

4.2.4 Direkte Interaktion von Sojaprotein und/oder seinen Inhaltsstoffen mit Nährstofftransportern... 100

4.2.5 Einfluss der Aminosäurenzusammensetzung verschiedener Proteinquellen auf den Glucosetransport ... 101

4.2.6 Beeinflussung von Signalkaskaden und Hormonen durch Sojaprotein und/oder seine Inhaltsstoffe und mögliche Auswirkungen auf den Glucosetransport ... 104

4.2.6.1 Extrapolation auf in vivo-Verhältnisse... 107

4.5 Schlussfolgerungen und Ausblick... 115

4.5.1 Auswirkungen auf die Mucosaentwicklung und den intestinalen Nährstofftransport bei milchernährten Wiederkäuern ... 115

4.5.2 Tiergesundheit und Fütterungsempfehlung ... 117

5. Zusammenfassung ...118

6. Summary ...120

7. Literaturverzeichnis ...122

8. Anhang ...153

8.1 Puffer und Lösungen ... 153

8.1.1 Präparation jejunaler Bürstensaummembranvesikel (BSMV)... 153

8.1.2 Messung der Substrataufnahmen in jejunale BSMV ... 154

9. Danksagung...157

Abkürzungsverzeichnis

Zusätzlich zu allgemein üblichen Abkürzungen wurden folgende Abkürzungen verwendet:

Abb. Abbildung

ANOVA analysis of variance AP Alkalische Phosphatase

Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) AS Aminosäure

ATP(ase) Adenosintriphosphat(ase)

BSE Bovine spongiforme Enzephalitis BSM Bürstensaummembran

BSMV Bürstensaummembranvesikel

cAMP cyclic adenosine monophosphate (zyklisches Monophosphat) CAS Kontrollgruppe Casein

Ci Curie

cpm counts per minute (Zerfallsrate pro Minute) d day (Tag)

Da Dalton

DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft DPP IV Dipeptidylpeptidase IV

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGTA Ethylenglycol-bis(ß-aminoethylether)-N,N,N`,N`-tetraacetat

HE Hämatoxylin-Eosin (-Färbung)

HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N`-2-ethansulfonsäure Kap. Kapitel

kDa Kilodalton (Molekulargewicht) KGW Körpergewicht

KM Körpermasse

Km MICHAELIS-MENTEN-Konstante, Halbsättigungskonstante bei sättigbarem Transport (Substrataffinität)

ME Metabolizable Energy (Umsetzbare Energie) min Minute

MJ Megajoule

MOPS (3-[N-Morpholino] propanesulfonic acid)

mRNA messenger ribonucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure) n sample number (Stichprobenumfang)

N Nitrogenium (Stickstoff)

NaPiIIa/b Natrium-abhängiger Phosphattransporter Typ IIa/b p probability value (Irrtumswahrscheinlichkeit) PDCAA Protein Digestibility Corrected Amino Acid Score PEPT1 Protonen-abhängiger Peptidtransporter Typ 1

pHa pH-Wert außerhalb der Vesikel (Inkubationsmedium) pHi pH-Wert innerhalb der Vesikel

Pi anorganisches (inorganic) Phosphat PKA/C Protein-Kinase-A/C

r Radius

r² Bestimmtheitsmaß Rp Rohprotein

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur

s Sekunde

S Substrat-Konzentration

SGLT1 Natrium-abhängiger Glucosetransporter Typ 1 (sodium-dependent glucose transporter 1)

SP Versuchsgruppe Sojaprotein (Soyprotein)

SPAA Versuchsgruppe Sojaprotein + Aminosäurenmix (Aminoacids) SPI Sojaproteinisolat

Tab. Tabelle

Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethan TS Trockensubstanz

U unit

V Substrat-Aufnahme

Vmax maximale Aufnahmerate (Transportkapazität) x¯ arithmetisches Mittel

Chemische Elemente wurden nach der internationalen Nomenklatur abgekürzt.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Modell des Substrattransports an einer intestinalen Epithelzelle... 2

Abb. 2: Hypothetisches Modell des SGLT1 ... 4

Abb. 3: Topologie-Modell des NaPiIIa... 7

Abb. 4: Topologie-Modell des humanen PEPT1 ... 10

Abb. 5: Möglichkeiten zur konventionellen Verarbeitung von Sojabohnen... 15

Abb. 6: Zusammensetzung der verschiedenen Diäten (CAS, SP, SPAA) ... 25

Abb. 7: Schematische Darstellung der Mg²⁺-EGTA-Präzipitation zur Anreicherung von apikalen BSMV... 33

Abb. 8: Schematische Darstellung der Schnellfiltrationstechnik... 40

Abb. 9: Zeitlicher Verlauf der Glucoseaufnahme in BSMV des proximalen (A) und distalen (B) Jejunums von Ziegenlämmern in An- (■,●,▲) und Abwesenheit (□,○, ) eines vesikeleinwärts gerichteten Na⁺-Gradienten... 56

Abb. 10: Zeitlicher Verlauf der Phosphataufnahme in BSMV des mittleren Jejunums von Ziegenlämmern in An- (■,●,▲) und Abwesenheit (□,○, ) eines vesikeleinwärts gerichteten Na⁺-Gradienten... 57

Abb. 11: Initiale Substrataufnahmen in BSMV des proximalen (A) und mittleren (B) Jejunums in Anwesenheit von 100 mmol·l^-1 Na⁺ und 0,4 mmol·l^-1 Glucose bzw. 0,3 mmol·l^-1 Phosphat im Inkubationsmedium. ... 58

Abb. 12: Initiale Peptidaufnahme (Gly-Sar) in BSMV des distalen Jejunums in Anwesenheit eines H⁺-Gradienten von pH 5,9 im Inkubationsmedium zu pH 7,8 im Vesikel- inneren und einer Gly-Sar-Konzentration von 0,25 mmol·l^-1 im Inkubations- medium... 59

Abb. 13: Repräsentative Kinetik der Glucoseaufnahme in BSMV des proximalen Jejunums (A) bzw. der Phosphataufnahme des mittleren Jejunums (B) in Abhängigkeit der Substratkonzentration... 60

Abb. 14: Repräsentative Kinetik der Gly-Sar-Aufnahme in BSMV des distalen Jejunums in Abhängigkeit der Substratkonzentration... 61 Abb. 15: Kinetik und Scatchard plot der kalkulierten, spezifischen Na⁺-abhängigen

Glucoseaufnahme in BSMV des proximalen Jejunums von Ziegenlämmern bei unterschiedlicher Proteinversorgung... 62 Abb. 16: Kinetische Parameter (Vmax und Km) des spezifischen Na⁺-abhängigen Glucose-

transports in BSMV des proximalen Jejunums von Ziegenlämmern in Abhängig- keit der Fütterung. ... 63 Abb. 17: Hemmung des Na⁺-unabhängigen Glucosetransports in BSMV des proximalen

Jejunums von Ziegenlämmern mit Phloretin. ... 65 Abb. 18: Kinetik und Scatchard plot der kalkulierten, spezifischen Na⁺-abhängigen

Phosphataufnahme in BSMV des mittleren Jejunums von Ziegenlämmern bei

unterschiedlicher Proteinversorgung... 66 Abb. 19: Kinetische Parameter (Vmax und Km) des Na⁺-abhängigen Phosphattransports in

BSMV des mittleren Jejunums von Ziegenlämmern in Abhängigkeit der

Fütterung. ... 67 Abb. 20: Kinetik und Scatchard plot der kalkulierten, spezifischen H⁺-abhängigen

Peptidaufnahme (Gly-Sar) in BSMV des distalen Jejunums von Ziegenlämmern bei unterschiedlicher Proteinversorgung... 68 Abb. 21: Kinetische Parameter (Vmax und Km) des spezifischen H⁺-abhängigen Transports

von Glycylsarcosine (Gly-Sar) in BSMV des distalen Jejunums von Ziegen-

lämmern in Abhängigkeit der Fütterung. ... 69 Abb. 22: Beeinflussung der Zottenausbildung des Jejunums von Ziegenlämmern durch

unterschiedliche Proteinquellen im Milchaustauscher (HE-Färbung, 10-fache

Vergrößerung; Färbung B. Leppich)... 75

Abb. 26: Modell des transzellulären Transports von Glucose durch die Enterozyte... 106 Abb. 27: Beeinflussung des Plasmaglucosespiegels bei Ziegenlämmern durch

unterschiedliche Proteinversorgung. ... 107 Abb. 28: Beeinflussung der Anflutungsgeschwindigkeit von Glucose im Plasma durch

die unterschiedliche Proteinversorgung bei Ziegenlämmern... 109 Abb. 29: Beeinflussung der Aktivitäten von Aminopeptidase N und Dipeptidylpeptidase

IV (DPP IV) des distalen Jejunums bei Ziegenlämmern nach unterschiedlicher Proteinversorgung. ... 113

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Fütterungsplan am Beispiel von Tier 14... 24 Tab. 2: Aminosäurenzusammensetzung der einzelnen Diäten... 26 Tab. 3: Im Rahmen der Versuchsdurchführung verwandte Chemikalien... 49 Tab. 4: Alter und Gewicht der Ziegenlämmer zu Beginn und Ende des Versuchs,

Versuchsdauer und Gewichtszunahme... 51 Tab. 5: Pi - und Gesamtprotein-Konzentrationen im Plasma von Ziegenlämmern bei

unterschiedlicher Proteinversorgung. ... 52 Tab. 6: Spezifische Aktivitäten und Anreicherungsfaktoren der Markerenzyme von

apikalen¹ und basolateralen² Membranen der jejunalen BSMV-Präparation bei Ziegenlämmern mit unterschiedlicher Proteinversorgung (Diät) zur Darstellung des Präparationserfolges. ... 54 Tab. 7: Vmax- und Km-Werte für den Na⁺-abhängigen Glucosetransport bei

verschiedenen Spezies ... 92 Tab. 8: Vmax- und Km-Werte für den Na⁺-abhängigen Phosphattransport bei

verschiedenen Spezies ... 93 Tab. 9: Vmax- und Km-Werte für den H⁺-abhängigen Peptidtransport (Glycylsarcosin)

bei verschiedenen Spezies ... 93 Tab. 10: Zusammensetzung der in der BSMV-Präparation verwandten Lösungen... 153

1. Einleitung

Dass qualitative und quantitative Nahrungsbestandteile die Proliferation der Mucosa- oberfläche im Darm des Wiederkäuers beeinflussen können, ist schon lange bekannt.

Insbesondere thermisch und chemisch behandelte Proteine verursachen eine strukturelle Modulation des Epithels. Inwieweit ein Zusammenhang mit funktionellen Veränderungen im Prozess der Mucosaproliferation und deren Regulation besteht, ist allerdings noch relativ unerforscht. In dieser Arbeit sollte daher der Einfluss von Milchaustauschern, in denen Anteile von Milchprotein durch Sojaprotein ersetzt wurden, sowie die nutritive Aufwertung des pflanzlichen Proteins durch die Anpassung der Aminosäurenzusammensetzung von Soja- und Milchprotein, auf die funktionellen Eigenschaften der Darmmucosa beim präruminierenden Wiederkäuer untersucht werden. Im besonderen Blickpunkt lag hierbei der Transport von Glucose, Phosphat und dem Peptid Glycylsarcosin über die apikale Bürstensaummembran des jejunalen Darmepithels. Die resultierenden Ergebnisse sollten einen Beitrag zur Erarbeitung von Ernährungsregimen für junge Wiederkäuer leisten, wobei eine Verbesserung der Tiergesundheit in der Aufzuchtphase im Vordergrund stand.

1.1

Für die Aufnahme von Nährstoffen spielt das Dünndarmepithel mit seinen Transportsystemen eine zentrale Rolle. Epithelgewebe sind flächenförmige Zellverbände, die zur Bedeckung der

Gesamtheit die Bürstensaummembran bilden. Durch diese enorme Oberflächenvergrößerung wird die Resorption von Nährstoffen zusätzlich erleichtert und ein optimaler transepithelialer Stoffaustausch gewährleistet. Neben der einfachen Diffusion entlang eines Konzentrations- gefälles durch die Doppellipidmembran des Darmepithels bzw. parazellulär, welche nur für Stoffe bis zu einer bestimmten Maximalgröße und vor allem für ungeladene Moleküle in nennenswertem Ausmaß möglich ist, nehmen proteinvermittelte, selektive Transportprozesse den Hauptanteil am epithelialen Stoffaustausch ein. Sie erfolgen zum einen ebenfalls passiv aufgrund eines Konzentrationsgefälles über erleichterte Diffusion durch Poren bzw. Carrier.

Zum anderen können sie auch aktiv unter Energieverbrauch entgegen einem Konzentrations- gradienten über Ionenpumpen und Cotransporter oder Symporter ablaufen. Je nach Triebkraft werden dabei verschiedene Transportmechanismen unterschieden (Abb. 1). Beim primär- aktiven Transport wird die aus der ATP-Hydrolyse gewonnene Energie unmittelbar für den Pump-Mechanismus der basolateral sitzenden, sogenannten ATPasen verwendet (Na⁺/K⁺- ATPase).

Lumen

+

-

+

-

3 Na⁺ 2 K⁺

K⁺

Blut

Na⁺

H⁺

PEPT1 H⁺

Peptide AS

GLUT 2 Na⁺

SGLT1 Glucose

GLUT2

Glucose Dipeptide

Tripeptide

Peptidomimetika

P_i

H₂PO₄^-/HPO₄^2-

3 Na⁺ NaPiIIb

Hydrolyse

Lumen

+

-

+

-

Lumen

+

-

+

-

3 Na⁺ 2 K⁺

3 Na⁺ 2 K⁺

K⁺ K⁺ K⁺

Blut

Na⁺

H⁺

PEPT1 H⁺

Peptide AS

GLUT 2 Na⁺

SGLT1 Glucose

GLUT2

Glucose Dipeptide

Tripeptide

Peptidomimetika

P_i

H₂PO₄^-/HPO₄^2-

3 Na⁺ NaPiIIb

Hydrolyse

Abb. 1: Modell des Substrattransports an einer intestinalen Epithelzelle

Schematisch ist der Mechanismus des aktiven Transports von Glucose (SGLT1), Phosphat (NaPiIIb) und Peptiden (PEPT1) über die apikale Membran des Jejunums dargestellt (eigene Darstellung).

Ist ein Substrattransport an die Tätigkeit und den dadurch entstehenden Ionengradienten dieser primär-aktiven Transportprozesse gekoppelt, spricht man von einem sekundär-aktiven Transportprozess (SGLT1). Für den tertiär-aktiven Transport (PEPT1) kann sogar noch ein weiteres System involviert sein, z.B. ein Na⁺/H⁺-Austauscher, um den für den Carrier nötigen Ionengradienten aufzubauen.

1.1.1 Mechanismen des Na

-abhängigen Glucosetransports

Der wachsende und sich entwickelnde Organismus ist auf eine hohe Energiezufuhr über die Nahrung angewiesen, um die während dieser Zeit besonders benötigte Energie für sämtliche Auf- und Umbauprozesse im Körper bereitstellen zu können. Bei präruminierenden Wiederkäuern (1-3 Wochen alt) wird der aufgenommene Milchzucker (Lactose) aus der Nahrung durch das intestinale Enzym Lactase zu D-Glucose und D-Galactose hydrolysiert.

Die Glucose stellt hier den direkten Grundbaustein für die Energiegewinnung durch ATP- Synthese über die Glycolyse dar. Die Galactose kann erst nach weiteren Umbauschritten zu Glucose-6-Phosphat, einem Intermediat der Glycolyse, zur Energiegewinnung dienen.

Die Glucose liefert außerdem das Kohlenstoffgerüst für die Synthese von Aminosäuren und Lipiden und wird zur Auffüllung der Glycogenspeicher in Leber und Muskulatur benötigt.

Die roten Blutkörperchen und das Nierenmark sind zur Energiegewinnung vollständig auf Glucose angewiesen, das Gehirn zum Teil.

Die Glucose wird bei Monogastriern und auch bei Wiederkäuern hautsächlich sekundär-aktiv über den in der apikalen Membran von jejunalen Enterozyten sitzenden, Na⁺-gekoppelten Cotransporter SGLT1 (SLC (solute carrier family) 5 (sodium glucose) A1 (member 1)) absorbiert (KAUNITZ u. WRIGHT 1984, MOE et al. 1985).

(SHENNAN u. BEECHEY 1995), Lungengewebe der Maus (ICARD u. SAUMON 1999), Herz- und Skelettmuskel (ELFEBER et al. 2004), Gehirn von Schwein und Rind (POPPE et al. 1997, NISHIZAKI et al. 1995) und menschliche Mundschleimhautzellen (OYAMA et al.

1999) konnten in Folgearbeiten nachgewiesen werden, jedoch ist die physiologische und klinische Relevanz in den meisten Fällen noch nicht eindeutig geklärt.

Untersuchungen zur Topologie des SGLT1 wurden hauptsächlich an Menschen und bei Kaninchen durchgeführt. Die Abb. 2 zeigt ein hypothetisches Modell des SGLT1 vom Kaninchen (PUNTHEERANURAK et al. 2007). Demnach besitzt das Transportprotein 14 transmembranale Segmente, wovon die letzten 5 die Glucosebindungsstelle bilden (TURK et al. 1996). Intrazellular sind Bindungsstellen zur Phosphorylation durch Proteinkinasen vorhanden (WRIGHT et al. 1992). Es besteht je nach Spezies aus 662 - 665 (664 bei Schaf und Rind) Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von ca. 73 (Rind) - 75 kDa (ZHAO et al. 2005, PUNTHEERANURAK et al. 2007). Die Aminosäuresequenz des SGLT1-Proteins verschiedener Säugetierspezies wurde im Lauf der Evolution in einem hohen Ausmaß konserviert. So weisen z.B. bovines SGLT1-Protein und das von Schaf, Maus, Ratte, Pferd, Mensch und Kaninchen eine 84 - 97%ige Homologie auf (WRIGHT et al. 1992, TARPEY et al. 1995, ZHAO et al. 2005).

Abb. 2: Hypothetisches Modell des SGLT1 (PUNTHEERANURAK et al. 2007)

Die Substrate D-Glucose, D-Galactose, α-Methyl-D-Glucopyranose und 3-O-Methyl-α-D- Glucose werden vom SGLT1 mit absteigender Affinität transportiert (IKEDA et al. 1989, WRIGHT 1993, HEDIGER et al. 1995). Allgemein besitzt der Transporter eine hohe Substrataffinität mit geringer Transportkapazität. Dadurch ist eine effiziente Absorption bei niedrigen Substratkonzentrationen möglich (WOLFFRAM et al. 1989). Wie alle (sekundär-) aktiven Transportvorgänge ist auch der Glucosetransport über den SGLT1 sättigbar. Weitere Untersuchungen zeigten, dass der SGLT1 nicht nur Kohlenhydrate transportiert, sondern vermutlich eine polyfunktionale Aufgabe im transepithelialen Stoffaustausch einnimmt. So kann er z.B. entweder zusätzlich zum Substrat als Cotransporter, oder in Abwesenheit von Substrat als Kanal auch noch Wasser (ZAMPIGHI et al. 1995, LOO et al. 2002, ZEUTHEN et al. 2006) oder Harnstoff (LEUNG et al. 2000) und womöglich weitere, bisher nicht untersuchte Stoffe transportieren.

Der SGLT1 wird über einen transmembranalen Na⁺-Gradienten angetrieben, welcher wiederum über eine basolateral lokalisierte Na⁺/K⁺-ATPase aktiv aufrechterhalten wird (CRANE et al. 1961, WRIGHT et al. 1993). Nach Bindung von zwei Na⁺-Ionen an der luminalen Transporterseite kann durch Konformationsänderung ein Glucosemolekül von extrazellulär nach intrazellulär transportiert werden (WRIGHT et al. 2003). Durch die Bindung von Natrium an den Transporter erhöht sich dessen Affinität für Glucose (STEVENS et al. 1984), wobei hingegen bei völliger Abwesenheit von extrazellulärem Natrium der Glucosetransport über den SGLT1 zum Erliegen kommt (WRIGHT et al. 1994, ASCHENBACH et al. 2000a). Aufgrund dieser Eigenschaft kann der SGLT1 gehemmt werden, indem man Natrium zum Beispiel durch Kalium oder andere monovalente Kationen ersetzt. Weiterhin ist der SGLT1 selektiv durch das Glucosid Phlorizin hemmbar. Die Hemmung erfolgt durch kompetitive Anlagerung an die Glucosidbindungsstelle des Proteins

benötigt (der Hauptanteil des Gesamtphosphats im Körper ist im Knochen lokalisiert).

Daneben spielt Pi (anorganisches Phosphat) als Bestandteil des Energiestoffwechsels (ATP) eine wichtige Rolle in der Regulation des Energiehaushaltes und wird als Puffersubstanz im Säure-Basenhaushalt benötigt. Pi ist außerdem elementarer Bestandteil von Zellmembranen (Phospholipide) und des genetischen Materials (Nukleinsäuren). Der wachsende Organismus hat zudem einen erhöhten Pi-Bedarf aufgrund von verstärktem Knochenaufbau und höherer Stoffwechselrate.

Da der Pansen bei milchernährten Wiederkäuern noch nicht ausgebildet ist, hat der endogene P-Kreislauf und die Sezernierung von Pi über den Speichel keine Bedeutung.

Ein großer Teil des epithelialen Pi-Transports in Niere und Darm des Wiederkäuers wird über Na⁺-abhängige Transportprozesse moduliert. Bei Monogastriern und auch bei adulten Wiederkäuern (ROSOL u. CAPEN 1996), sowie bei ruminierenden und milchernährten Lämmern (SCHARRER 1985) ist das mittlere Jejunum Hauptlokalisation der Pi-Absorption.

Bei adulten Ziegen (SCHRÖDER et al. 1995, SCHRÖDER u. BREVES 1996, HUBER et al.

2000) und bei präruminierenden Ziegenlämmern (ROESLER 2002, HUBER et al. 2002, HUBER 2004, unveröffentlicht) existiert im Jejunum ein Na⁺-abhängiges, sekundär-aktives Transportsystem für Pi. Auch im Jejunum von Schafen wurde ein Na⁺-abhängiger Phosphattransport beschrieben (SCHRÖDER et al. 1995). Allerdings konnten SHIRAZI- BEECHEY et al. (1989, 1991a, 1996) im Duodenum von Schaflämmern und adulten Schafen nur einen H⁺-abhängigen Transport nachweisen. Im Duodenum von Ziegen konnten HUBER et al. (2002) ebenfalls nur einen protonenabhängigen Pi-Transport, aber keinen Na⁺- abhängigen aufzeigen. Im Gegensatz zum Monogastrier, bei dem Pi im Dünndarm nur Na⁺- abhängig transportiert wird (BOROWITZ u. GRANRUD 1992), kann Pi im Darm beim Wiederkäuer demnach über zwei verschiedene Transportsysteme absorbiert werden, welche sich in der Substrataffinität, der Morphologie, der Ionen-Abhängigkeit und der Beeinflussung durch diätetische Faktoren unterscheiden (HUBER et al. 2002).

Die Na⁺-abhängigen Pi-Cotransporter (NaPi I - III; SLC (solute carrier family) 34 (sodium phosphate) A1 - 3 (member 1 - 3)) lassen sich aufgrund ihrer Struktur in 3 Familien einteilen, Typ I, II und III, von denen der Typ II im Tierreich evolutionsgeschichtlich am weitesten verbreitet ist und somit hauptverantwortlich für den regulierbaren Anteil des epithelialen Pi-

die Subtypen IIa und IIc hauptsächlich in der apikalen Membran des proximalen Tubulus der Niere zu finden sind (MAGAGNIN et al. 1993, SEGAWA et al. 2002), der Typ IIa konnte zusätzlich im Gehirn der Ratte (MULRONEY et al. 2004), Osteoklasten (KHADEER et al.

2003) und osteoblastartigen Zellen (LUNDQUIST et al. 2007) nachgewiesen werden. Der phylogenetisch ältere Subtyp IIb befindet sich dagegen hauptsächlich in der Bürstensaummembran von Enterozyten, aber auch in Lunge, Leber, Pankreas, Prostata und Milchdrüse (HILFIKER et al. 1998, HUBER et al. 2007a). Die intestinale Form hat eine Größe von 90-108 kDa (WERNER et al. 1998, WERNER u. KINNE 2001, HATTENHAUER et al. 1999, HUBER et al. 2000, 2003), besitzt 8 transmembranale Domänen (LAMBERT et al. 1999) mit intrazellulär gelegenem C- und N-Terminus und 3 kleinen extrazellulären Schleifen (Abb. 3).

Abb. 3: Topologie-Modell des NaPiIIa

Durch Bindung eines Na⁺-Ions kann der Transporter entweder unbeladen translozieren (Slippage, Na⁺-Strom) oder ermöglicht die Bindung von Pi und eines oder mehreren Na⁺- Ionen bei pH 7,4 (MURER et al. 2000).

Der Nachweis des apikal lokalisierten Transportproteins NaPiIIb im Jejunum erfolgte sowohl für Monogastrier (HILFIKER et al. 1998, MURER et al. 2000), als auch für adulte (HUBER et al. 2000, 2002) und präruminierende Ziegen (ROESLER 2002). Durch Quantifizierung der Proteinmenge und Vergleich mit der Transportkapazität konnte eine positive Korrelation zwischen den beiden Parametern erhoben werden (HUBER et al. 2002), was bedeutet, dass der Na⁺-abhängige Phosphattransport im Darm hauptsächlich über den NaPiIIb vermittelt wird. Dies konnte ebenfalls beim Kaninchen bewiesen werden (TAUFIQ et al. 1997).

1.1.3 Mechanismen des H

-abhängigen Peptidtransports

Für eine effiziente Versorgung des Organismus mit wichtigen Verbindungen bzw. Elementen wie Aminosäuren, Kohlenstoff und Stickstoff ist die Fähigkeit zur aktiven Aufnahme von Oligopeptiden durch membranständige Transportsysteme von größter Bedeutung. Der Abbau von aufgenommenen Nahrungsproteinen im Intestinaltrakt durch pankreatische Proteasen und membrangebundene Hydrolasen führt zu einer beträchtlichen Menge an sehr unter- schiedlichen Oligopeptiden und freien Aminosäuren. Der Großteil dieses Gesamt- Aminosäurenstickstoffs wird dabei in Form von Di- und Tripeptiden absorbiert. Bei Monogastriern und auch beim Wiederkäuer geschieht dies über den Dünndarm, dessen Transportsysteme somit eine lebenswichtige Rolle einnehmen. Den ersten direkten Beweis für eine Transporter-vermittelte Oligopeptidaufnahme über das Dünndarmepithel beim Wieder- käuer lieferten BACKWELL et al. (1995) mit BSMV beim Schaf.

Der gut charakterisierte PEPT1 (SLC (solute carrier family) 15 (oligopeptide transporter) A1 (member 1)) gehört zur Familie der ubiquitär vorkommenden Di- und Tripeptidtransporter.

Die erste Klonierung von PEPT1-mRNA gelang in BSMV von Kaninchen (FEI et al. 1994), es folgten weitere Nachweise im intestinalen Gewebe von verschiedenen Tierarten (Ratte:

SAITO et al. 1995, Schwein: WINCKLER et al. 1999, Huhn: CHEN et al. 2002) und dem Menschen (LIANG et al. 1995). Auch beim Wiederkäuer konnte PEPT1-mRNA in

intestinalen BSMV isoliert werden (Schaf: MATTHEWS et al. 1996 und Rind: CHEN et al.

1999). Im Gegensatz zu früheren Annahmen ist mittlerweile bekannt, dass sich die Existenz des PEPT1 nicht nur auf das Darmgewebe beschränkt, sondern dass der Transporter auch in anderen Geweben wie Pankreas, Niere, Leber und Gallengängen bei verschiedenen Spezies zu finden ist (BOCKMAN et al. 1997, SHEN et al. 1999, ZHOU et al. 2000, THAMOTHARAN et al. 1997, KNÜTTER et al. 2002).

Der intestinale Transporter PEPT1 ist für die aktive Resorption einer Vielzahl von Di- und Tripeptiden aus der Nahrung verantwortlich, woraus sich eine geringe Substratspezifität ableiten lässt. Ausgehend von den 20 proteinogenen Aminosäuren ergeben sich allein 400 Dipeptid- bzw. 8000 Tripeptidsubstrate mit Molekulargewichten von 132 - 576 Da (RUBIO- ALIAGA u. DANIEL 2002, BRANDSCH et al. 2004, DANIEL u. KOTTRA 2004).

Zusätzlich akzeptiert der PEPT1 auch verschiedene pharmakologisch relevante Peptidomimetika als Substrate, wie ß-Lactamantibiotika und Proteaseinhibitoren, die δ- Aminolävulinsäure (GANAPATHY et al. 1995, BRETSCHNEIDER et al. 1999, NIELSEN et al. 2001, BRANDSCH et al. 2004). Je nach Substrat lassen sich unterschiedliche Affinitäten und Transportkapazitäten ermitteln (hohe Affinität (Km) < 0,5 mmol·l^-1, mittlere Km 0,5 - 5 mmol·l^-1, niedrige Km > 5 - 15 mmol·l^-1; BRETSCHNEIDER et al. 1999, BRANDSCH et al.

2004, LUCKNER u. BRANDSCH 2005).

Der apikal vorhandene tertiär-aktive H⁺/Peptidsymporter PEPT1 wird über einen zelleinwärts gerichteten Protonengradienten angetrieben, welcher aus der Aktivität des ebenfalls in der apikalen Membran sitzenden Na⁺/H⁺-Austauschers resultiert. Dessen Triebkraft wiederum wird durch einen einwärtsgerichteten Na⁺-Gradienten generiert, der durch die basolateral befindliche Na⁺/K⁺-ATPase aufgebaut wird (GANAPATHY u. LEIBACH 1983). Das luminale Mikroklima an der Bürstensaummembran der Epithelzellen des Jejunums weist

und PKA liegen intrazellulär. In die Substratbindung sind verschiedene Histidinreste involviert (LIANG et al. 1995, FEI et al. 1998, RUBIO-ALIAGA u. DANIEL 2002).

Abb. 4: Topologie-Modell des humanen PEPT1 (DANIEL 2004)

1.2

Die Verwendung von künstlich hergestellten Milchaustauschern mit variabel einstellbaren Inhaltsstoffen hat eine lange Tradition in der Viehwirtschaft, da die Verfütterung der (Voll-) Milch als Tierfutter durch hohe Produktionskosten und die Nutzung als menschliches Nahrungsmittel für den Landwirt nicht mehr ökonomisch ist. Eine relativ neue Entwicklung dagegen ist die Nachfrage nach noch kostengünstigerem Ersatz für herkömmliche Milchaustauscher in der Jungtieraufzucht von Wiederkäuern. Viele Studien befassen sich deshalb mit dem Ersatz von Milchprotein (Casein), dem teuersten Inhaltsstoff der Milch, in Form von billigerem, pflanzlichem Protein. Die Sojabohne stellt eine Proteinquelle von hoher Qualität dar (PDCAA-Wert: Sojaprotein ~ 1, Casein = 1), besitzt im Gegensatz zu anderen pflanzlichen Proteinquellen alle essentiellen Aminosäuren (allerdings zum Teil in geringeren Mengen als das Casein) und einen hohen Proteingehalt. Sie ist kostengünstig, momentan noch nahezu unbegrenzt verfügbar, und daher scheinbar gut als Alternative geeignet, das Casein zu ersetzen. Der Marktanteil an Milchaustauschern auf Sojaproteinbasis ist deshalb in den letzten Jahren stetig gewachsen und von wirtschaftlicher Bedeutung.

Auch in der Ernährung des Menschen hat die Verwendung von Sojaprodukten in der westlichen Kultur seit Mitte der 80er Jahre des zwanzigsten Jahrhunderts stetig an Zuwachs gewonnen. Traditionell aus der asiatischen Küche bekannt, erlangte die Sojabohne bei uns erst nur als Ersatz tierischen Proteins für vegane Ernährungsformen oder bei Lactose- Unverträglichkeit (hauptsächlich als Babynahrung) ein besonderes Interesse. In den letzten Jahren jedoch wurde Soja aufgrund sich wandelnder Verzehrgewohnheiten, zunehmender Aufklärung in ernährungsphysiologischen Fragen, herstellungstechnischer Qualitätssteigerung

scheinbar sichere Alternative gegenüber tierischen Produkten auf dem Speiseplan des Menschen. Ebenso sinnvoll und seit 2001 auch Gesetz (seit dem 1. Januar 2001 gilt auch EU- weit ein Verfütterungsverbot für Tiermehl an alle lebensmittelliefernden Tiere) ist es, risikobelastetes Tiermehl aus der Viehfütterung zu entfernen und z.B. durch Soja als Proteinquelle zu ersetzen, um nicht nur die Tiergesundheit zu gewährleisten, sondern auch den Menschen vor der Aufnahme von Krankheitserregern oder anderen unerwünschten Inhaltsstoffen über das Essen von Fleisch zu schützen (Carry-Over). Aus diesen Zusammenhängen wird die enge Beziehung zwischen Mensch und Tier, bzw. der Fütterung von Nutztieren und der sich daraus ergebenden Qualität von tierischen Lebensmitteln deutlich. Das Sprichwort „Du bist, was Du isst“ hat heute mehr Bedeutung denn je erlangt.

Allerdings gibt es trotz aller positiven Eigenschaften auch immer wieder Zweifel an der Wirksamkeit bzw. Funktionalität und sogar an der Ungefährlichkeit von Sojaprodukten (DIVI et al. 1997, SETCHELL et al. 1998, SUN et al. 2002). Verantwortlich sind unter anderem bereits altbekannte Ergebnisse aus Tierversuchen und die Erfahrungen in der landwirtschaftlichen Viehaufzucht. Auch heute noch werden Milchaustauscher auf Sojabasis für Durchfallgeschehen bzw. Krankheit und verminderte Leistung in der Jungtieraufzucht verantwortlich gemacht (KUNZ 2003). Warum pflanzliche Proteine eine andere Wirkung auf den Darm und auf den Intermediärstoffwechsel haben als körpereigene Proteine liegt zum Teil an den besonderen Inhaltsstoffen, die im folgenden Kapitel beschrieben werden. Je nach Produkt sind diese in mehr oder weniger großen Mengen enthalten und können verschiedene Effekte ausüben.

1.3

Ein Faktor der speziellen Wirkung von pflanzlichen Produkten sind so genannte anti-nutritive Inhaltsstoffe. In der Sojabohne sind dies z.B. Trypsin-Inhibitoren (Kunitz-Trypsin-Inhibitor, Bowman-Birk-Inhibitor), welche die Aktivität des körpereigenen Chymotrypsins und Trypsins senken und somit auch die proteolytische Aktivität. Sie korrelieren negativ mit der Verdaulichkeit des Sojaproteins (BOWMAN 1944, KUNITZ 1945, JANICEK et al. 1969, FLAVIN 1982). Eine langfristige Hemmung der Verdauungsenzyme führte außerdem zu

einer verstärkten Produktion von Verdauungsenzymen und in Folge zu Pankreas- Hypertrophie/-Hyperplasie, was letztendlich Wachstumsstörungen bedingte (LIENER 1994, FRIEDMAN u. BRANDON 2001).

Phytate in Sojaprodukten binden Mineralstoffe wie Calcium, Magnesium, Eisen und Zink unlöslich im Magen-Darm-Trakt, so dass sie dem Körper nicht mehr zur Verfügung stehen und zu Mangelerscheinungen und Wachstumsstörungen führen können (CHERYAN 1980).

In Soja sind außerdem Lektine (Hämaglutinine) enthalten, komplexe Glykoproteine, die in der Lage sind, an Glykoprotein-Rezeptoren von Epithelzellen der intestinalen Mucosa zu binden und von dort aus biochemische Reaktionen auszulösen. So können Lektine verschiedene Stoffwechselvorgänge wie die Zellteilung, die ribosomale Proteinbiosynthese, oder das Immunsystem negativ beeinflussen. In der Blutbahn können sie zur Agglutination von Blutzellen führen (LIENER 1991). Die Aufnahme von Lektinen kann außerdem zu Wachstumsstörungen und Diarrhoen führen, die durch profunde Veränderungen der Mucosamorphologie und -struktur, wie Reduktion der Oberfläche durch erhöhte Zellverluste und verkürzte Zotten, verursacht werden (LORENZSONN u. OLSEN 1982). In diesem Zusammenhang können erniedrigte Absorptionsraten von Nährstoffen (DONATUCCI et al.

1987) und Beeinträchtigungen der Membranpermeabilität beobachtet werden (GREER u.

PUSZTAI 1985).

Zu den Inhaltsstoffen der Sojabohne gehören auch die nachfolgend beschriebenen sekundären Pflanzenstoffe. In Sojaproteinisolat, der reinsten Form des Proteins, sind noch ca. 4 % (42,1 mg·g^-1 SPI) der Gesamtmenge enthalten. Von 136 identifizierten Phytochemikalien gehören 16 zu den Isoflavonen (Daidzein, Genistein und Glycitein) mit einem Anteil von ~ 0,3 % (3 mg·g^-1 SPI), 22 zu den Saponinen mit einem dreifach höheren Gehalt im Vergleich zu den Isoflavonen (10 mg·g^-1 SPI), 56 zu den Lysophospholipiden (0,3 mg·g^-1 SPI) und 39 zu den

schwächere Wirkung als das endogene Östrogen (LECLERCQ u. HEUSON 1979, SETCHELL u. CASSIDY 1999). Durch den Eingriff in den Hormonstatus sind die Auswirkungen auf den Stoffwechsel sehr weitreichend und vielschichtig und umfassen z.B.

positive Effekte auf die Gesunderhaltung von Herz-Kreislauf (ADLERCREUTZ u. MAZUR 1997), Knochen (SETCHELL u. LYDEKING-OLSEN 2003, LYDEKING-OLSEN et al.

2004, MA et al. 2008) und Brustgewebe (ARLISS u. BIERMANN 2002) sowie die Verringerung von Beschwerden in der Menopause (KRONENBERG u. FUGH-BERMAN 2002).

Die Wirkung der Saponine ist weniger gut untersucht, es wurde ein Cholesterin-senkender Einfluss beschrieben (SIDHU u. OAKENFULL 1986), eine anticarcinogene Wirkung (RAO u. SUNG 1995), ein Schutz vor chemischen Leberschädigungen (MIYAO et al. 1998), östrogene Interaktionen sowie eine Beeinflussung der Zellproliferation (ROWLANDS et al.

2002).

Spezielle Proteine der Sojabohne wie Glycinin und ß-Conglycinin können als antigene Faktoren zu allergischen Reaktionen des Darmepithels (gastrointestinale Allergie) führen (KILSHAW u. SISSONS 1979, LALLES et al. 1996a, DREAU u. LALLES 1999). Diese zeigen sich makroskopisch als Villusatrophie mit Verlust von Integrität, Kryptenhyperplasie und einer gesteigerten Zellerneuerungsrate (KILSHAW u. SLADE 1982). Äußerlich sind höhere Rektaltemperaturen, dünnbreiige Faeces oder Diarrhoe zu beobachten (SILVA et al.

1986). Die Folgen sind verminderte Leistung, schlechterer Gesundheitszustand und eventuell sogar Tod der Tiere.

Allgemein stehen sekundäre Pflanzenstoffe im Verdacht, entweder direkt mit Nährstoff- transportern, Enzymen und Rezeptoren zu interagieren, oder durch Eingriff in Wasser- und Elektrolythaushalt Verdauung und Absorption (negativ) zu beeinflussen (BOUDRY et al.

2003).

1.4

Ein Sojaproteinisolat wird durch wässrige oder alkoholische Extraktion und anschließender Proteinfällung aus der Sojabohne gewonnen (Abb. 5). Durch chemische und thermische Behandlungsverfahren, die unerwünschte Inhaltsstoffe verringern oder unwirksam machen, konnte die Nutzbarkeit von Sojaprotein erheblich gesteigert werden. So wird zum Beispiel die Aktivität von Trypsin-Inhibitoren, Phytaten und Lektinen (Hämaglutinine) durch Hitzebehandlung (LIENER 1981) oder Thiol-Zugabe bzw. Fraktionierung (FRIEDMAN u.

BRANDON 2001) zu 80 - 90 % reduziert, sowie die Verdaulichkeit des Proteins und die Bioverfügbarkeit einiger Mineralstoffe verbessert (ERDMANN u. FORBES 1981).

Rohöl Sojabohnen

Entfettete Sojaflocken

Reinigen Zerkleinern Schälen

Feuchte Hitze, 60 - 75°C Fettextraktion,

Hexan 66 - 71°C

Weichen (Wasser) NaOH oder HCL- Extraktion Zentrifugation Toasten

Vermahlen Alkaliextraktion,

NaOH pH 6,8 - 10 Zentrifugation Präzipitation, HCL pH 4,5 Zenrifugation Sprühtrocknung

Hypoallergene Produkte entstehen durch zusätzliche Ethanolbehandlung der entfetteten Sojaflocken (SISSONS et al. 1982) oder durch Hydrolysierung des Sojaproteins (LALLES et al. 1995). Diese Verfahren führen zu einer Denaturierung der in Sojabohnen enthaltenen Antigene Glycinin und ß-Conglycinin.

Durch eine kombinierte, chemische Behandlung mit disulfidspaltenden Verbindungen (Reduktionsmittel) wie Cystein, N-Acetyl-Cystein, Glutathion, Natriumsulfit und Natriummetasulfit können die Autooxidation (enzymatische Bräunung) der Nahrungsproteine vermieden und unerwünschte Reaktionsprodukte verringert werden.

Um störende sensorische Eigenschaften der Produkte zu vermeiden, müssen außerdem die Phenole entfernt werden. Dazu werden Sojaproteinisolate mit Aktivkohle behandelt (LIENER 1994).

Zur weiteren Aufbesserung von Sojaprodukten aus modernen hochwertigen Sojaproteinisolaten werden diesen, aufgrund des gegenüber tierischen Lebensmitteln unterschiedlichen chemischen Profils pflanzlicher Lebensmittel und den damit verbundenen Defiziten, verschiedene Zusatzstoffe beigesetzt. In der Säuglingsernährung gehören zu diesen heutzutage üblicherweise Methionin (limitierte Aminosäure in Leguminosen), Carnitin (notwendig zur optimalen mitochondrialen Oxidation von langkettigen Fettsäuren, ist defizient in pflanzlichen Nährstoffen), Taurin (funktioniert als Antioxidant und ist mit Glycin Hauptkonjugat der Gallensäuren im Säuglingsalter; in Muttermilch im Überfluss vorhanden), Eisen und Zink (Sojaproteinisolat enthält immer noch 1,5 % Phytasen, welche Eisen und Zink unlöslich binden). Calcium und verschiedene Vitamine werden ebenfalls supplementiert, um die Nachteile des pflanzlichen Proteins auszugleichen (AMERICAN ACADEMY OF PEDIATRICS 1998). Dennoch empfiehlt z.B. das BUNDESINSTITUT FÜR RISIKOBEWERTUNG (2007) in einer Stellungnahme eine enge Indikation für die Verwendung von Säuglingsnahrung auf Sojabasis, da die Eignung als Ersatz für Kuhmilchprodukte immer noch begrenzt ist durch geringere Verdaulichkeit, limitierte Verfügbarkeit einiger Mineralstoffe und dem relativ hohen Gehalt an Isoflavonen, deren langfristige Wirkung auf Säuglinge noch umstritten ist.

Auch in der Jungtieraufzucht werden Milchaustauschern auf Sojaproteinbasis mittlerweile verschiedene Zusatzstoffe beigefügt, um die Qualität des Jungtierfutters und somit Wachstum

sowie B-Vitamine und Vitamin C), Calcium, Phosphor, Eisen, Selen, Kupfer und verschiedene Probiotika.

Als Alternative zu chemisch-thermischen Behandlungen oder der Verwendung von Zusatzstoffen ist ebenfalls der Einsatz genetisch veränderter Pflanzen denkbar. Mehrere verschiedene Forschungsansätze wurden und werden momentan verfolgt, um die Gene der Sojabohne dem gewünschten Gehalt an Nährstoffen und anderen Inhaltsstoffen anzupassen (Methionin-reich, Inhibitor-arm, etc.: LIENER 1994, FALCO et al. 1995, DE LUMEN et al.

1999). Inzwischen wird z.B. das Genom von Mais und der Sonnenblume als Quelle für die gentechnische Erzeugung von Soja mit hohem Methioningehalt genutzt (ZELLER 1999).

1.5

In früheren Studien wurde gezeigt, dass sich generell durch den Einsatz von Milchaustauschern anstelle der traditionellen Milchtränke bei Wiederkäuern die Morphologie des Darmepithels (Länge, Dichte und Form der Zotten) veränderte. Dabei verursachte die Fütterung von herkömmlichem Milchaustauscher mit Kuhmilch-Casein als Proteinquelle nur geringere Veränderungen (kürzere, runde Zotten), was LALLES et al. (2001) auf den geringeren Protein- bzw. Aminosäuregehalt des Milchaustauschers zurückführten. Der Ersatz von Casein durch pflanzliche Sojaproteine (Sojaproteinkonzentrat) dagegen rief starke morphologische Veränderungen hervor, wie Villusatrophie, Verlust der Integrität und unregelmäßige und gekräuselte Gestalt der Villi (SEEGRABER u. MORRILL 1979, 1982, 1986, MONTAGNE et al. 1999). Damit einher gingen verminderte Futteraufnahme, geringere Gewichtszunahmen und schlechterer Gesundheitszustand (Diarrhoen und sogar Tod der Tiere), woraus sich wirtschaftliche Verluste für den Landwirt ergaben, die umso stärker

untersucht. SEEGRABER u. MORRILL (1986) und LALLES et al. (1995) konnten eine verminderte Xylose-Absorptionsfähigkeit bei Kälbern feststellen, die anteilig Sojaprotein im Milchaustauscher erhielten. BOUDRY et al. (2003) zeigten eine verminderte jejunale Glucoseaufnahme beim Ferkel und postulierten, dass Sojaproteine direkt in den Ionen- und Nährstofftransport eingreifen. Zu Transportstudien an mit Sojaprotein gefütterten Ziegen- lämmern gibt es bislang keine verfügbare Literatur.

1.6

Die Gründe für die morphologischen Veränderungen am Darmepithel und die verminderte Nutzbarkeit von Sojaprotein sind noch nicht restlos geklärt, könnten aber in der grundsätzlich geringeren Verdaulichkeit von pflanzlichen Proteinen, in ihrer hydrolytischen Resistenz (NIELSEN et al. 1988) und dem höheren Verlust von endogenem Protein (BUSH et al. 1992, LALLES et al. 1996b) liegen. Im Folgenden sind mehrere, möglicherweise ursächlich verantwortliche Mechanismen aufgeführt:

Milchaustauscher mit Sojazusatz koagulieren nicht im Labmagen, bilden keine langen, festen Klumpen wie herkömmliche Milchaustauscher auf Caseinbasis, so dass die Verweilzeit kürzer ist und die Proteasen geringere Angriffsmöglichkeiten haben (SHOPTAW et al. 1937, GORRILL u. THOMAS 1967). Daraus resultiert eine suboptimale Aufspaltung der Nahrungs- bestandteile. Zudem kann Sojaprotein die Aktivität verschiedener membranständiger Enzyme (Lactase, alkalische Phosphatase, Aminopeptidase N) des Jejunums bei Kälbern hemmen (MONTAGNE et al. 1999).

Die spezifische dreidimensionale Proteinstruktur und/oder die Aminosäurenzusammensetzung des Caseins in herkömmlichen Milchaustauschern scheint ebenso eine wichtige Rolle für den Nährstofftransport zu spielen. So konnten z.B. MABJEESH et al. (2003) bei mit Heu und Mais gefütterten Schaflämmern zeigen, dass nach einer täglichen zusätzlichen abomasalen Casein-Infusion (Casein + Wasser) über 10 Tage die Glucoseabsorption gegenüber der nur mit Wasser infundierten Kontrollgruppe doppelt so hoch war. Die gemessene SGLT1- Proteinmenge korrelierte in der Casein-Gruppe mit der Glucoseaufnahme, jedoch nicht in der Kontrollgruppe, was zu der Annahme führte, dass das Casein einen direkten stimulierenden

Einfluss auf die Affinität und Aktivität des SGLT1 besaß und dass die SGLT1-Aktivität posttranslational reguliert wurde. Des Weiteren aktivierte Casein im Gegensatz zu Sojaprotein die pankreatische α-Amylase (LE DREAN et al. 1995), diese spaltet Stärke auf und erhöht so die Glucosekonzentration im Darmlumen. Eine hohe Glucosekonzentration wiederum stimulierte die Transportkapazität für Glucose (FERRARIS u. DIAMOND 1989, SHIRAZI- BEECHEY 1996). Die Fütterung von Sojaprodukten ist dagegen mit verringerten Absorptionsraten von Nährstoffen (SEEGRABER u. MORRILL 1986, LALLES et al. 1995, BOUDRY et al. 2003) und der Hemmung von Verdauungsenzymen assoziiert (LE DREAN et al. 1995, MONTAGNE et al. 1999), und führte zu starken degenerativen Veränderungen der Darmmucosa, die sich in Wachstumsstörungen und Diarrhoen äußerten (SEEGRABER u.

MORRILL 1986, MONTAGNE et al. 1999).

Allerdings werden solch starke Veränderungen des Dünndarmepithels wahrscheinlich nicht (allein) durch Aminosäurenmangelzustände oder die Proteinstruktur an sich verursacht, sondern auch durch verschiedene Inhaltsstoffe der Sojaprodukte, welche mit dem Darm interagieren und die enzymatische Verdauung und die Absorptionskapazität der Mucosa modifizieren können (MONTAGNE et al. 1999). KILSHAW u. SLADE (1982) und SEEGRABER u. MORRILL (1986) glaubten in allergenen Reaktionen des Darms (Zerstörung der Darmzotten) und einer vermutlich damit einhergehenden verringerten resorbierfähigen Epitheloberfläche die Gründe für verminderte Leistungsfähigkeit der Jungtiere infolge von Nährstoffverlusten und Immunreaktionen zu sehen. Mit neueren hypoallergenen Sojaproteinisolaten, in denen reaktive Glycinin und ß-Conglycinin-Gehalte deutlich verringert wurden, sind derart drastische Symptome einer allergischen Reaktion des Darms bei Kälbern nicht mehr zu beobachten (MIR et al. 1991, LALLES et al. 1995).

Obwohl viele negative Wirkungen aufgrund der in Sojabohnen enthaltenen Phytochemikalien

an sich, sprich durch die vorhandene Aminosäurenzusammensetzung des Sojaproteins oder der damit verbundenen Sekundär- bzw. Tertiärstruktur.

KANJANAPRUTHIPONG (1998) nahm an, dass die Hauptursache für die Veränderungen im Darmepithel in dem unterschiedlichen Aminosäurenmuster von Casein und Sojaprotein begründet ist, der Fokus lag hierbei auf den essentiellen Aminosäuren. Im Sojaprotein ist die limitierende Aminosäure das Methionin (sowie Cystein als Schwefelquelle), aber auch Lysin- und Threoningehalte befinden sich oft unter denen im Casein. In der Arbeit setzte er deshalb die drei seiner Ansicht nach entscheidenden Aminosäuren zu. Dies erzeugte zwar keinen Schutz vor Veränderungen im Darmepithel, verbesserte aber die Wertigkeit des Proteins durch Erhöhung der Verdaulichkeit von Aminosäuren. Die Aufbesserung beruhte vermutlich auf dem erhöhten Angebot freier, absorbierbarer Aminosäuren. Ähnliche Effekte konnten schon früher bei Kälbern durch die Zugabe von Methionin, Lysin und Isoleucin zu Milchaustauschern auf Sojaproteinbasis beobachtet werden (JENKINS u. EMMONS 1983).

Die alleinige Gabe von Glutamin als Aminosäurenzusatz ergab dagegen laut BLOME et al.

(2003) und DRACKLEY et al. (2006) keine wesentliche Abschwächung der negativen Effekte des Sojaproteins.

Es scheint also darauf anzukommen, welche Aminosäuren in welchem Maße zugesetzt werden, um alle negativen Auswirkungen von Sojaprotein zu kompensieren und so die Funktionstüchtigkeit des Darmepithels, sowie die Darmgesundheit und folglich auch die Tiergesundheit zu gewährleisten.

Bisher gibt es keine Berichte über den Einfluss einer Supplementation aller dem Casein gegenüber defizienten Aminosäuren in Milchaustauschern auf Sojaproteinbasis auf das Dünndarmepithel, weder bei Ziegen noch bei anderen Spezies.

1.7

1.7.1 Hypothesen

1) Sojaproteinisolat beeinflusst den apikalen Nährstofftransport im jejunalen Darm- epithel von Ziegenlämmern im Vergleich zum Casein

Die Ursachen hierfür könnten vor allem in der dem Casein gegenüber differenten Aminosäurenzusammensetzung und/oder der damit verbundenen andersartigen Sekundär- und Tertiärstruktur des Sojaproteins liegen, was sich direkt oder indirekt auf die Nährstoff- transportmechanismen auswirkt. Einflüsse von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen könnten ebenfalls eine Rolle spielen.

2) Sojaproteinisolat mit Aminosäurensupplementation übt im Vergleich zu Sojaprotein allein eine unterschiedliche Wirkung auf den apikalen Nährstofftransport im jejunalen Darmepithel von Ziegenlämmern aus

Durch Angleichen der Aminosäurenzusammensetzung des Milchaustauschers mit Sojaprotein auf die des Caseinhaltigen Milchaustauschers sollte dieser Faktor keinen Einfluss mehr auf den apikalen Nährstofftransport besitzen. Ursachen für dennoch eintretende Veränderungen

1.7.2 Zielsetzung

Im Rahmen eines gemeinsamen DFG-Projektes mit dem Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf (Forschungsbereich Ernährungsphysiologie

„Oskar Kellner“), sollte deshalb der Einfluss von Sojaproteinisolat auf bestimmte Nährstofftransporter (Glucose, Phosphat, Peptid) auf funktioneller Ebene im Dünndarm- epithel (Jejunum) von präruminierenden Wiederkäuern untersucht werden (SP-Gruppe). Als Vergleichskontrolle wurde Gewebe von Ziegenlämmern, die mit herkömmlichem (Kuh-) Milchaustauscher auf Caseinbasis ernährt wurden, herangezogen (CAS-Gruppe). Zusätzlich sollte die Möglichkeit der Kompensation von negativen Effekten des Sojaproteins durch Ergänzung aller dem Casein gegenüber defizitären Aminosäuren erfasst werden (SPAA- Gruppe).

Untersucht werden sollte in diesen drei Fütterungsgruppen die Nährstoffaufnahme über die apikale Membran, da dieser Transportvorgang oft den geschwindigkeitsbestimmenden und regulierbaren Schritt für die transepitheliale Nährstoffaufnahme darstellt.

Ein Fernziel war es, aus diesen Untersuchungen ein neues, optimiertes Ernährungsregime für junge Wiederkäuer abzuleiten, um eine Verbesserung der Tiergesundheit in der Aufzuchtphase zu erreichen. Eine wirtschaftliche Bedeutung begründete sich darin, dass die Studie Hinweise geben könnte, ob Hersteller von Milchaustauschern auf Sojabasis diese durch Zugabe einer bestimmten Aminosäurenmixtur aufwerten können.

2. Material und Methoden

2.1

Der Fütterungsversuch fand im Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Forschungsbereich Ernährungsphysiologie „Oskar Kellner“, Dummerstorf, im Rahmen eines gemeinsamen DFG-Projektes statt.

Die Untersuchungen wurden an 24 männlichen Ziegenlämmern der Rasse „Weiße Deutsche Edelziege“ durchgeführt. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Ziegenzucht und erhielten bis zur Trennung vom Muttertier natürlicherweise Kolostrum und Muttermilch.

Bei der Einstallung waren die Lämmer 4 - 12 Tage alt und wurden nach dem Zufallsprinzip in 3 Fütterungsgruppen zu je 8 Tieren aufgeteilt. Alle Tiere derselben Gruppe wurden zusammen in einer Box auf Spaltenboden ohne Einstreu gehalten. Die Tiere verfügten über Spielzeug zur Beschäftigung.

Die Temperatur wurde über eine Klimaanlage permanent auf 18°C gehalten, zusätzlich befand sich eine Wärmequelle in Form einer Infrarotlampe in einem gesonderten Bereich der Box.

2.1.1 Fütterung

Nach der Einstallung wurden die Lämmer über 6 Tage an Kuhmilch aus dem Sammelgemelk institutseigener Milchkühe adaptiert. Die Tiere erhielten ihre Tränkerationen einzeln über

Tab. 1: Fütterungsplan am Beispiel von Tier 14

Datum Lebenstag Futter Menge Fütterungfrequenz

19.01.2006 Geburt 1

Muttermilch ad libitum beliebig

20.01.1006 2 Muttermilch ad libitum beliebig

21.01.2006 3 Muttermilch ad libitum beliebig

22.01.2006 4 Muttermilch ad libitum beliebig

23.01.2006 Einstallung

5 Muttermilch/

Kuhmilch ad libitum beliebig

24.01.2006 Adaptionsphase 6

Kuhmilch

ad libitum

3x täglich*¹

25.01.2006 7 Kuhmilch 450 ml·Tier^-1 3x täglich*¹

26.01.2006 8 Kuhmilch 450 ml·Tier^{4 -1} 3x täglich*¹

27.01.2006 9 Kuhmilch 500 ml·Tier^-1 3x täglich*¹

28.01.2006 10 Kuhmilch 500 ml·Tier^-1 3x täglich*¹

29.01.2006 11 Kuhmilch 500 ml·Tier^-1 3x täglich*¹

30.01.2006 Übergangsphase

12 Halbdiät

(½ Kuhmilch + ½ Diät) 140 ml·

[kg KGW]^-1

2x täglich*²

31.01.2006

13 Halbdiät

(½ Kuhmilch + ½ Diät) 140 ml·

[kg KGW]^-1

2x täglich*²

01.02.2006 Versuchsphase 14

Volldiät 140 ml·

[kg KGW]^-1

2x täglich*²

15.03.2006 Schlachttag 57

Volldiät 140 ml·

[kg KGW]^-1 1x morgens, 3h vor Schlachtung

Änderungen im Futterregime sind fett gedruckt.

*¹: 3x täglich = um 7, 12 und 17 Uhr

*²: 2x täglich = um 7 und 17 Uhr

Im Anschluss an die Adaptionsphase erfolgte eine 2-tägige Übergangsphase, in der der Kuhmilch die jeweils endgültige Versuchsdiät zur Hälfte beigemischt wurde.

Die Basis der Versuchsdiät bildete in allen 3 Gruppen ein herkömmliches Vollmilchpulver (260 g Fett·kg^-1, Fa. Nordmilch eG, Bremen). Die Diäten wurden durch gleiche Mengen Lactose und Proteine ergänzt, wobei sich diese in der Art des zugesetzten Proteins unter- schieden (Abb. 6). Die Höhe des jeweiligen Proteinzusatzes wurde so gewählt, dass 50 % des Gesamtproteins in der Diät durch die gewünschte Proteinquelle ersetzt wurden.

CAS

SP

SPAA

Abb. 6: Zusammensetzung der verschiedenen Diäten (CAS, SP, SPAA)

Die Kontrollgruppe CAS erhielt zusätzlich das milcheigene Protein Casein (säuredenaturiertes Casein, Molkereigesellschaft Lauingen mbH, Lauingen), in der Versuchsgruppe SP wurde Sojaproteinisolat (Isolated soy protein Supro-901, Fa. Interfood Deutschland GmbH, Bad Nauheim) zugesetzt. In der Versuchsgruppe SPAA wurde das Sojaproteinisolat zusätzlich mit einer Aminosäurenmixtur ergänzt, die beschaffen war, die Unterschiede in der Aminosäurenzusammensetzung von Casein und Sojaprotein

Aminosäurenmix Sojaproteinisolat

(Supro-901, Interfood)

Sojaproteinisolat

(Supro-901, Interfood)

Casein

(Lauingen)

Lactose Lactose Lactose

Milchpulver

(Nordmilch)

Milchpulver

(Nordmilch)

Milchpulver

(Nordmilch) 1000 g

500 g

Tab. 2: Aminosäurenzusammensetzung der einzelnen Diäten (Analyse durch das FBN Dummerstorf)

CAS SP SPAA

Aminosäuren Casein

(g·[16 g N]^-1)

Sojaproteinisolat

(g·[16 g N]^-1)

Sojaproteinisolat + Aminosäuren

(g·[16 g N]^-1)

essentiell Isoleucin 4,93 4,51 4,89

Leucin 8,69 8,2 8,62

Lysin 7,76 6,97 7,74

Methionin 2,11 1,6 2,09

Phenylalanin 5,2 5,07 5,1

Threonin 4,56 4,33 4,48

Tryptophan 1,14 1,07 1,08

Valin 5,71 5,06 5,59

semi - Cystein 0,67 1,11 1,01

essentiell Tyrosin 4,71 3,62 4,65

Histidin 3,14 2,96 3,09

Arginin 3,68 5,37 4,51

nicht Alanin 3,49 4,22 3,5

essentiell Asparaginsäure 7,79 9,59 8,69

Gln/Glu 17,93 15,79 17,72

Glycin 1,96 3,07 2,52

Prolin 10,31 7,46 10,2

Serin 5,71 5,34 5,7

Summe 99,49 95,34 101,18

Die Tiere erhielten pro Tag 21 g TS·[kg KGW]^-1 mit einem Energiegehalt von 0,4 MJ ME·[kg KGW]^-1 und einem Rohproteingehalt von 7 g Rp·[kg KGW]^-1. Wasser stand den Tieren ad libitum zur Verfügung. Aus Gründen der artgerechten Haltung bekamen sie zusätzlich 60 g Heu pro Gruppe und Tag und ein wenig Stroh zur Beschäftigung und Befriedigung des Kautriebes. Da die aufgenommenen Raufuttermengen pro Tier so gering waren, wurden sie bei der Nährstoffberechnung nicht berücksichtigt. Die Versuchsdauer betrug 6 - 7 Wochen.

2.2

Am Tag vor der Schlachtung wurde den Ziegenlämmern 30 und 5 min vor und zwischen 5 und 420 min nach der Morgenfütterung mehrmals Blut aus der Vena jugularis entnommen.

Dieses wurde in lithium-heparinisierten Probenröhrchen (Monovette^®, Sarstedt, Nümbrecht) zentrifugiert, um daraus Plasma zu gewinnen. Die Plasmaproben wurden anschließend bei

−20°C eingefroren und bis zur Analyse der gewünschten Blutparameter gelagert.

Die Tiere wurden zwischen dem 55. - 66. Lebenstag per Bolzenschuß betäubt und durch Eröffnung der beiden Arteriae carotides communes entblutet. Die Bauchhöhle wurde eröffnet, der Darm entnommen und von diesem Teile des proximalen, medialen und distalen Jejunums abgeteilt. Danach wurden die einzelnen Darmstücke aufgeschnitten, in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung gespült und so vom Darminhalt befreit.

Für die Durchführung von Transportstudien wurden die Darmstücke im Ganzen in Aluminiumfolie verpackt, beschriftet und sofort in Flüssigstickstoff schockgefroren.

Da die Weiterverarbeitung der Proben im Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover stattfinden sollte, wurde das Probenmaterial im Anschluss an die Entnahme in Trockeneis verpackt und direkt nach Hannover transportiert. Dort erfolgte die Lagerung bis zum Versuchsbeginn bei −80°C.

2.3

2.3.1 Anorganisches Phosphat

2.3.1.1 Prinzip

Die Pi-Bestimmung im Plasma erfolgte photometrisch mittels Molybdat-/Vanadat-Reaktion (PETER 1982). Pi bildet in salpetersaurer Lösung mit Ammoniummolybdat und Ammoniumvanadat einen gelben Farbkomplex. Die Farbintensität kann bei einer Wellenlänge von 405 nm photometrisch gemessen werden und ist der Konzentration an anorganischem Phosphat in der Probe proportional.

2.3.1.2 Durchführung

Die entnommenen Blutproben waren bei −20 °C gelagert und wurden auf Eis aufgetaut. Nach dem Auftauen wurden sie bei 4°C mit 2000 U·min^-1 für 15 min zentrifugiert. Zur Enteiweissung der Proben wurden je 50 µl des erhaltenen Überstandes im Verhältnis 1:10 mit 500 µl Trichloressigsäure (1,2 mol·l^-1) in ein Reaktionsgefäß gegeben und erneut 10 min bei 3000 U·min^-1 und 4°C zentrifugiert.

Für die Messung wurden aus dem Überstand der enteiweissten Proben Aliquots von 400 µl mit je 400 µl Ammoniumvanadat und Ammoniummolybdat in Einmal-Küvetten (2,5 ml Makro, 12,5 x 12,5 x 45 mm, Brand GmbH & Co. KG, Wertheim) pipettiert und mit einem Rührspatel gut durchmischt. Jede Probe wurde als Doppelbestimmung angesetzt. Zur Ermittlung der Pi-Konzentration in den Proben wurde in einer weiteren Küvette eine Standardlösung (1:10 verdünnt) aus kommerziell erhältlichem, humanem Kontrollserum (Precinorm^® U) mit ebenfalls je 400 µl Ammoniumvanadat und Ammoniummolybdat vermengt. Nach 10 min wurde die Extinktion der Proben und der Standardlösung (mit bekannter Pi-Konzentration) bei einer Wellenlänge von 405 nm gegen einen Leerwert