Schnellfiltrationstechnik

2.6.1.1 Prinzip

Die Schnellfiltrationstechnik (Abb. 8) ist eine etablierte Methode zur Durchführung von Transportstudien an isolierten Bürstensaummembranvesikeln. Die bei der Vesikelpräparation (Kap. 2.4.2) gewonnenen apikalen Membranfragmente bilden ein kleines geschlossenes Kompartiment, in dem Membranintegrität und transmembranale Transportfunktionen erhalten geblieben sind. Gibt man nun ein geeignetes Substrat zu der Vesikelsuspension, kann dieses über die in der Membran lokalisierten Transportsysteme in das Vesikelinnere aufgenommen werden. Zur Beendigung des Vorganges wird eine eiskalte Stopplösung zu der Suspension gegeben und das Ganze auf einen Filter überführt. Durch mehrfaches Waschen unter Vakuumabsaugung wird das außen verbliebene Substrat entfernt. Die Verwendung eines radioaktiv markierten Substrates ermöglicht es, die Höhe der Substrataufnahme in die Vesikel mittels Flüssigkeits-Szintillationszählung zu bestimmen.

Abb. 8: Schematische Darstellung der Schnellfiltrationstechnik

Eiswanne

Dispensette

Vakuumpumpe

Stopp-lösung

Substrat- Vesikel- Suspension

Nutsche

Fritte

Stopfen Filter

2.6.1.2 Durchführung

Die Na⁺-abhängigen Transportstudien für Glucose und Phosphat wurden in Anlehnung an die von SCHRÖDER u. BREVES (1996) und SCHRÖDER et al. (2000) beschriebene Methode der Schnellfiltrationstechnik zur Messung von Phosphataufnahmen in Ziegendärme durchgeführt. Für die Protonen-abhängige Aufnahme von Peptiden wurden die Versuchsbedingungen nach WOLFFRAM et al. (1998) modifiziert.

Die Vesikelsuspensionen wurden auf Eis aufgetaut und mit einer 1 ml-Spritze (ERSTA) und einer 0,45 x 23 mm-Kanüle (Braun) durch mehrmaliges Aufziehen erneut homogenisiert, um verklumpte Membranvesikel zu trennen. Die Aufnahmestudien wurden je nach Versuchs-ansatz bei RT oder bei 37°C durchgeführt.

Zum Starten der Substrataufnahme in die Bürstensaummembranvesikel wurde die Vesikel-suspension zum radioaktiv markierten Inkubationsmedium (Anhang, Tab. 11-13) in ein kleines Reagenzglas (Tubes, 3,5 ml, 55 mm x 12 mm Ø, Fa. Sarstedt, Nümbrecht) gegeben, kurz gevortext (Heidolph REAX 2000, Stufe 5, Heidolph Instruments, Schwabach) und je nach Versuchsansatz eine definierte Zeit lang inkubiert. Die Reaktion wurde nach Ablauf dieser Zeit mit 1 ml Stopp-Lösung (Anhang, Tab. 11-13) abgebrochen und die Vesikel durch Schnellfiltration (Nitrocellulose-Membranfilter, 0,65 µm Porenweite, Sartorius AG, Göttingen) von der Lösung getrennt. Das Reagenzglas wurde noch einmal mit 1 ml Stopp-Lösung ausgespült und der Filter ebenfalls zweimal mit je 5 ml gewaschen (Dispensette, EM-dispenser, Hirschmann^®EM Techcolor, Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Eberstadt). Nun wurde der Filter mit einer Pinzette in ein Plastik-Vail (Pico Prias Vail™, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, USA) überführt und mit 4,3 ml Szintillationsflüssigkeit (Lumasafe™PLUS, Lumac-LSC B.V., Groningen, Niederlande)

zur Szintillationsflüssigkeit gegeben und gemessen. Alle Proben und die Blanks wurden in Dreifachbestimmung gemessen.

2.6.2 Berechnung der Substrataufnahme

2.6.2.1 Transportrate

Aus den gewonnenen Daten der Szintillationsmessungen (Kap. 2.6.1.2) und den ermittelten Proteinkonzentrationen in der Vesikelsuspension (Kap. 2.5.1.2) wurden die Aufnahmeraten*

für Glucose, Phosphat und Glycylsarcosin nach folgender Gleichung berechnet:

* Die Berechnung der Gesamtaufnahmen (Na⁺-/H⁺-abhängig) und der unspezifischen Aufnahme erfolgte mit obiger Formel, der sättigbare Transport wurde durch Subtraktion des unspezifischen Anteils von der Gesamtaufnahme kalkuliert.

2.6.2.2 Kinetische Parameter

Ist ein aktives Transportsystem an der Substrataufnahme beteiligt, besteht die Gesamt-aufnahme aus einem sättigbaren Anteil, dessen Kinetik mittels Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben werden kann, und einem nicht-sättigbaren, „diffusiblen“ Anteil. Anhand der

cpmT • [Protein] (mg·l^-1) (cpmP-cpmL) • [S] (nmol·l^-1) Aufnahme (nmol • [mg Protein]^-1) =

cpmP = cpm (counts per minute, Zerfallsrate pro Minute) in der Probe cpmL = cpm im Leerwert

cpmT = cpm im Total (Gesamtaktivität im Inkubationsmedium) [S] = Konzentration des Substrates im Inkubationsmedium [Protein] = Proteinkonzentration im Inkubationsansatz

Michaelis-Menten-Kinetik ist es möglich, die halbmaximale Sättigung Km als Maß für die Transporteraffinität und die maximale Transportrate Vmax des sättigbaren Transportvorganges zu bestimmen.

Michaelis-Menten-Gleichung:

V = Substrataufnahme (nmol·[mg Protein]^-1)

Vmax = Maximale Aufnahmerate (nmol·[mg Protein]^-1) [S] = Substratkonzentration

Km = Substratkonzentration bei halbmaximaler Sättigung (V = Vmax/2, in mmol·l^-1)

Unter Verwendung der berechneten Werte für die Substrataufnahme (Kap. 2.6.2.1) bei gleicher Inkubationsdauer und steigenden Substratkonzentrationen konnten so die kinetischen Parameter der Substrataufnahme ermittelt werden.

Vmax · [S]

Km + [S]

V =

2.6.3 Versuchsansatz zur konzentrationsabhängigen Glucose-aufnahme in BSMV des proximalen Jejunums

Die Aufnahmestudien wurden bei 6 verschiedenen Glucosekonzentrationen von 0,05; 0,1;

0,2; 0,4; 0,8 und 1,5 mmol·l^-1 durchgeführt. Die verschieden Inkubationsansätze wurden mit radioaktiv markierter [2-³H(N)]-D-Glucose (Moravek Biochemicals Inc., California, USA) versetzt. Die ³H-Glucose-Radioaktivität betrug 0,5 µCi pro 50 µl Ansatz. Zur Messung der Na⁺-abhängigen Glucoseaufnahme wurde ein Na⁺-haltiges (100 mmol·l^-1) Inkubationsmedium verwendet, zur Messung der Na⁺-unabhängigen Aufnahme wurde anstelle von Na⁺ eine äquivalente Menge an Kalium zu dem Medium gegeben (Anhang, Tab. 11).

Aus dem Inkubationsmedium wurden jeweils 40 µl entnommen und mit 10 µl Vesikel-suspension vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 10 s bei RT wurde die Reaktion mit eiskalter Stopp-Lösung (Anhang, Tab. 11) beendet und der Versuch wie in Kapitel 2.6.1.2 beschrieben weitergeführt. Für die Leerwerte wurden ebenfalls 40 µl Medium verwendet, die Gesamtaktivität der Probe wurde in 10 µl bestimmt.

2.6.4 Versuchsansatz zur konzentrationsabhängigen Phosphat-aufnahme in BSMV des mittleren Jejunums

Für den Na⁺-abhängigen Transport von Phosphat wurde ein Inkubationsmedium mit 100 mmol·l^-1 Na⁺ verwendet, zur Darstellung des Na⁺-unabhängigen Anteils der Substrataufnahme ein K⁺-haltiges Medium mit 100 mmol·l^-1 K⁺ (Anhang, Tab. 12). Durch die Zugabe verschieden großer Phosphatmengen wurden aus jedem Medium jeweils 6 verschiedene Phosphatkonzentrationen von 0,01; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 und 1,0 mmol·l^-1 hergestellt.

Die einzelnen Ansätze wurden zusätzlich mit 1 µCi · 100 µl^-132Pi (Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig) radioaktiv markiert. Das Gemisch aus radioaktivem und unmarkiertem Phosphat wurde vor Zugabe zu dem Inkubationsmedium durch einen Minisart-Filter (Porengröße 0,22 µm, Millex^®-Gv, Millipore, Cork, Irland) sterilfiltriert, um Pyrophosphate aus der Lösung zu entfernen. Pyrophosphate erhöhen den Anteil der unspezifischen Bindung an die Außenseite der Vesikel und verfälschen somit die Messergebnisse.

Die Substrataufnahme in die BSMV wurde gestartet, indem 80 µl Inkubationsmedium zu 20 µl Vesikelsuspension gegeben wurden. Für die Leerwerte wurden ebenfalls 80 µl Medium verwendet, die Gesamtaktivität der Probe wurde in 10 µl bestimmt. Die Inkubationsdauer betrug 10 s und fand bei RT statt.

2.6.5 Versuchsansatz zur konzentrationsabhängigen Peptid-aufnahme in BSMV des distalen Jejunums

Für die Aufnahmestudien wurden Inkubationsansätze mit 6 verschiedenen Peptid-konzentrationen von 0,25; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 und 10 mmol·l^-1 hergestellt. Als Substrat wurde Glycylsarcosin (Gly-Sar) verwendet, ein Peptid, das nicht von membranständigen Peptidasen gespalten werden kann. So konnte sichergestellt werden, dass der Transport des intakten Peptides und nicht der einzelnen Aminosäuren gemessen wurde. Die einzelnen Ansätze wurden mit jeweils 1 µCi · 100 µl^{-1 3}H-Glycylsarcosin (Moravek Biochemical Inc., California, USA) radioaktiv markiert. Um den protonenabhängigen Transport von Peptiden zu untersuchen, wurde ein Inkubationsmedium mit einem pH von 5,9 (pHa) hergestellt. In den Vesikeln lag ein pH-Wert von 7,8 (pHi) vor, so dass ein einwärtsgerichteter H⁺-Gradient geschaffen wurde. Die Protonen-unabhängige Aufnahme wurde in einem Außenmedium von pH 7,8 untersucht (Anhang, Tab. 13). Um die Aufnahme zu starten, wurden 80 µl Inkubationsmedium mit 20 µl Vesikelsuspension gemischt und 10 s lang bei 37°C inkubiert.

Die Leerwerte wurden mit 80 µl gemessen und die Gesamtaktivität in 10 µl.

2.6.6 Versuchsansatz zur zeitabhängigen Glucoseaufnahme in

BSMV des proximalen und distalen Jejunums

Vesikelinnere transportiert und dort angereichert („Overshoot-Phänomen“). Erst nach längerer Inkubationsdauer wird der Ausgleichswert wieder erreicht, da die Glucose aus den Vesikeln ins Medium zurück diffundiert. Dieser Versuchsansatz ist demnach zur Überprüfung der Vesikelintegrität geeignet.

Die zeitabhängige Aufnahme von Glucose wurde bei einer Konzentration von 0,4 mmol·l^-1 Glucose im Inkubationsmedium gemessen. Untersucht wurden der Na⁺-abhängige und der Na⁺-unabhängige Transport mit zwei verschiedenen Inkubationsansätzen wie in Kap. 2.6.3 beschrieben. Die Vesikelproben wurden bei 37°C zwischen 10 s – 4 h mit den Inkubations-medien inkubiert.

2.6.6.2 Linearität der initialen Na⁺-abhängigen Glucoseaufnahme

Dieser Versuch sollte dazu dienen, die Inkubationsdauer für die konzentrationsabhängigen Aufnahmeversuche festzulegen. Um zu überprüfen, in welchem Zeitraum die initiale Na⁺ -abhängige Glucoseaufnahme linear verläuft, wurden kurze Inkubationszeiten von 5 s – 25 s bei RT gewählt.

2.6.7 Versuchsansatz zur zeitabhängigen Phosphataufnahme in BSMV des mittleren Jejunums

2.6.7.1 „Overshoot“

Die zeitabhängige Aufnahme von Phosphat wurde bei einer Konzentration von 0,01 mmol·l^-1 Phosphat untersucht. Es gab zwei verschiedene Transportmedien, wie in Kap. 2.6.4 beschrie-ben. Die Inkubationszeiten lagen zwischen 10 s – 4 h und wurden bei 37°C durchgeführt.

2.6.7.2 Linearität der initialen Na⁺-abhängigen Phosphataufnahme

Die Na⁺-abhängige Phosphataufnahme zur Überprüfung des linearen Bereichs der initialen Phosphataufnahme wurde bei RT 5 s – 25 s lang gemessen. Die Substratkonzentration betrug 0,01 mmol·l^-1.

2.6.8 Versuchsansatz zur zeitabhängigen Peptidaufnahme in BSMV des distalen Jejunums

2.6.8.1 „Overshoot“

Die Überprüfung der Integrität der präparierten BSMV des distalen Jejunums erfolgte über zeitabhängige Glucoseaufnahmen (Kap. 2.6.6).

2.6.8.2 Linearität der initialen H⁺-abhängigen Peptidaufnahme

Die Linearität der H⁺-abhängigen Peptidaufnahme wurde bei 37°C zwischen 5 s – 25 s überprüft. Die Peptidkonzentration betrug 0,25 mmol·l^-1 im Inkubationsmedium.

2.6.9 Versuchsansatz zur Hemmung des Na

⁺

-unabhängigen

Transports mit Phloretin: „Zusatzversuch Hemmung

Die Versuchsdurchführung erfolgte wie in Kap. 2.6.3 dargestellt. Zusätzlich wurde ein Teil der Vesikelproben mindestens 30 min lang bei RT mit Phloretin vorinkubiert. Die Phloretinkonzentration in der Vesikelsuspension betrug 1 mmol·l^-1. Die Phloretin-Stammlösung wurde mit 70%igem Ethanol angesetzt, die Ethanolkonzentration in der Vesikelsuspension lag unter 1 % und hatte keinen Einfluss auf die Ergebnisse. Die ungehemmten Vesikelproben wurden mit der entsprechenden Menge 70%igem Ethanol aufgefüllt, um Volumenunterschiede auszugleichen. Die Messung der Phloretin-gehemmten Substrataufnahme erfolgte im Na⁺-unabhängigen Medium und 6 verschiedenen Konzentrationen (Kap. 2.6.3).

2.7

Chemikalien

Soweit nicht in Tab. 3 aufgelistet oder an entsprechender Stelle erwähnt, wurden sämtliche Chemikalien von den Firmen Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, und Merck KGaA, Darmstadt, bezogen und wiesen mindestens den Qualitätsstandard „pro analysi“ auf.

Tab. 3: Im Rahmen der Versuchsdurchführung verwandte Chemikalien

Substanz Produktbeschreibung Bezugsquelle

HEPES

N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure,

Puffer

Carl Roth GmbH&Co, Karlsruhe BioRad Protein Assay

Farbreagenz protein assay dye reagent

concentrate BioRad Laboratories GmbH, München

Bovines γ-Globulin bovine gamma globulin,

lyophilized BioRad Laboratories GmbH, München

Precinorm Precinorm^®U Control Sera,

lyophilized human sera Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Szintillationsflüssigkeit Lumasafe™Plus Lumac-LSC B.V., Groningen NL

3H-Glucose D-Glucose, [2-³H(N)]- Moravek Biochemicals Inc., California USA

3H-Glycylsarcosin Glycylsarcosine, [³H]- Moravek Biochemicals Inc., California USA

2.8

Statistik

Die Ergebnisse in den Tabellen und Abbildungen wurden entweder als Einzelwerte oder als arithmetische Mittelwerte ( x¯ ) mit Standardabweichung (SD) angegeben. Der Stichproben-umfang n steht für die jeweilige Anzahl der verwendeten Versuchstiere.

Die Errechnung der kinetischen Parameter Vmax und Km der konzentrationsabhängigen Aufnahmen, sowie die statistische Auswertung der Versuchsdaten erfolgte mit dem Softwareprogramm GraphPad Prism^® (GraphPad Prism Version 4.00 for Windows, GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Vor der statistischen Auswertung wurde zunächst überprüft, ob eine Gauß`sche Normalverteilung der Messwerte vorlag. Da alle Messpunkte innerhalb einer wahrscheinlichen Streubreite lagen, wurden Signifikanzen je nach Fragestellung unter Zuhilfenahme von Student`s T-Test oder One-way ANOVA getestet. Ergaben sich hierbei signifikante Unterschiede, wurden die Mittelwerte über Tukey-Kramer-Folgetests (Tukey`s post test) paarweise miteinander verglichen. Die Sättigungskurven der verschiedenen Substrataufnahmen wurden zusätzlich aus einer nicht-linearen Regression mittels Scatchard plot in eine lineare Form umgewandelt und anschließend mittels linearer Regression analysiert. Der Grad eines linearen Zusammenhanges wurde durch das Bestimmtheitsmaß (r²) und die Signifikanz der Regression beurteilt.

Für die Signifikanzangabe gilt:

p ≥ 0,05 nicht signifikant (n.s.) p < 0,05 niedrig signifikant (*) p < 0,01 signifikant (**) p ≤ 0,001 hoch signifikant (***)

3. Ergebnisse

3.1

Charakterisierung des Tiermodells

3.1.1 Tierdaten

Die erhobenen Tierdaten sind in Tab. 4 zusammenfassend dargestellt. Sowohl das Alter als auch das Gewicht der Ziegenlämmer zu Versuchsbeginn und am Schlachttag unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Ebenso verhielt es sich mit der Versuchsdauer und der Gewichtszunahme im Verlauf des Versuches.

Tab. 4: Alter und Gewicht der Ziegenlämmer zu Beginn und Ende des Versuchs, Versuchsdauer und Gewichtszunahme

Mittelwerte ± SD; n = 8; Signifikanzanalyse über One-way ANOVA und Tukey`s post test: nicht signifikant; CAS = Casein, SP = Sojaprotein, SPAA = Sojaprotein + Aminosäurenmix

3.1.2 Blutplasmawerte

In Tab. 5 sind die Plasmawerte für Phosphat und Gesamtprotein der Ziegenlämmer am Ende des Fütterungsversuchs (3 h nach Morgenfütterung) dargestellt. Die Werte der gemessenen Parameter lagen in für Ziegenlämmer bekannten physiologischen Bereichen. Die unter-schiedliche Proteinversorgung hatte keinen Einfluss auf die Konzentration von Phosphat im Plasma, allerdings war die Menge an Gesamtprotein in der Versuchsgruppe SPAA (Soja-protein + Aminosäurenmix) im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erniedrigt (p < 0,01).

Tab. 5: Pi - und Gesamtprotein-Konzentrationen im Plasma von Ziegenlämmern bei unterschiedlicher Proteinversorgung.

Probenentnahme 1 Tag vor der Schlachtung und 3 h nach der Morgenfütterung.

Mittelwerte ± SD; n = 8; Signifikanzanalyse über One-way ANOVA und Tukey`s post test: ** p < 0,01; CAS = Casein, SP = Sojaprotein, SPAA = Sojaprotein + Aminosäurenmix

Fütterungsgruppe Pi

(mmol·l^-1)

Gesamtprotein

(mg·ml^-1) CAS ^{2,80 ± 0,42} 56,24 ^{± 2,22}

SP ^{2,86 ± 0,45} 56,52 ± 1,28

SPAA ^{2,78 ± 0,46 52,17} ± 1,86 (**)

Im Dokument Einfluss der Proteinquelle im Milchaustauscher auf die Funktion der Nährstofftransporter im Jejunum von Ziegenlämmern (Seite 58-71)