Die R. equi-Pneumonie ist durch eine bilaterale, abszedierende Bronchopneumonie charakterisiert (MARTENS et al. 1982; ELLENBERGER u. GENETZKY 1986;
AINSWORTH 1999; WEIMAR 2006). Bei der chronischen Verlaufsform treten besonders im ventralen Bereich der Lunge Abszesse auf, die einen Durchmesser von 7 cm erreichen können und einen purulenten, gelb-schmierigen bis bröckelig-käsigen Inhalt haben (MAGNUSSON 1923; ELLENBERGER u. GENETZKY 1986).
Miliare dünnwandige Abszesse im Lungenparenchym sind seltener zu finden (BARTON u. HUGHES 1980) und treten eher bei akuten Pneumonien auf (MARTENS et al. 1982). Um die Abszesse herum ist das Lungengewebe verdickt oder eingeschmolzen. In manchen Fällen greift die Abszedierung auf die bronchialen und mediastinalen Lymphknoten über (BARTON u. HUGHES 1980). In der Sektion ist meistens ein für eine Rhodococcus equi-Pneumonie typisches Bild einer feuchten, schweren, dunklen, nicht kollabierten Lunge zu beobachten (SMITH u. ROBINSON 1981). In den betroffenen Bereichen sind die Atemwege mit mukopurulentem Sekret gefüllt (BARTON u. HUGHES 1980). Die Konsistenz der Veränderungen im Lungengewebe variiert im Anschnitt von speckig und derb bis hin zu rahmig und zähflüssig. Es können Lungenödeme und emphysematöse Bereiche der Lunge beobachtet werden (WEIMAR 2006).
Die histologische Untersuchung von veränderten Lungenbereichen lässt einen granulomatösen Charakter erkennen und um die nekrotischen Bereiche herum sind massenhaft Makrophagen und neutrophile Granulozyten zu finden, in denen zahlreiche phagozytierte, intakte Rhodokokken erkennbar sind (HILLIDGE 1986;
PRESCOTT 1991). Es werden außerdem alveoläre und interstitielle Ödeme dokumentiert (WEIMAR 2006).
Liegt eine gastrointestinale R. equi-Infektion vor, können Veränderungen vom Magen bis zum Dickdarm beobachtet werden. Im Darm sind oft Anzeichen einer ulzerativen Kolitis und Typhlitis zu finden (ROONEY 1966; CIMPRICH u. ROONEY 1977;
BARTON u. HUGHES 1980; BEECH und SWEENEY 1991).
3. Material und Methode
3 Material und Methode 3.1 Probanden
In der vorliegenden Studie wurde der Nachweis von Rhodococcus equi bei Fohlen in der Atemluft mit der kulturellen Isolierung aus dem Tracheobronchialsekret und dem Kot verglichen. Dazu wurde von 64 Warmblutfohlen im Alter von 20 bis 170 Tagen zwischen Mai und Oktober 2007 am gleichen Tag je eine Probe der Atemluft, des Tracheobronchialsekrets und eine Kotprobe gewonnen.
Die Fohlen sind auf einem Gestüt geboren und aufgewachsen, auf dem schon seit einigen Jahren durch Rhodococcus equi verursachte Fohlenpneumonien endemisch (bis zu 70 % der Fohlen) auftreten. Für die Tiere der vorliegenden Studie herrschten die gleichen Haltungs- und Fütterungsbedingungen.
3.1.1 Haltung der Stuten und Fohlen in der peripartalen Phase
Die hochtragenden Stuten wurden einige Tage vor dem Geburtstermin in einen räumlich und durch Hygieneschleusen von den anderen Stallungen getrennten Abfohlstall eingestallt. Hier standen den Stuten desinfizierte und frisch mit Stroh eingestreute Einzelboxen zur Verfügung.
Der gesamte Geburtsvorgang wurde von geschultem Personal überwacht.
Unmittelbar nach der Geburt wurde das neonate Fohlen einer kurzen Allgemeinuntersuchung unterzogen, der Nabel wurde mit einer auf 1 % verdünnten Chlorhexidindigluconat-Lösung (20 %, COM Pharma, 20539 Hamburg) desinfiziert und es wurde ein Klistier (FREKA-CLYSS, Fresenius Kabi AG, Bad Homburg) verabreicht. Ferner wurde sichergestellt, dass das Fohlen in den ersten Lebensstunden genügend Kolostrum aufnahm. Acht bis zehn Stunden post partum wurde jedes Fohlen von einem/r Tierarzt/Tierärztin allgemein untersucht. Diese Untersuchung bestand aus Adspektion hinsichtlich Fehlstellungen und Missbildungen, Palpation des Nabelstumpfes und der Leistengegend bei Hengstfohlen und Auskultation von Herz, Lunge und Trachea. Weiterhin wurde venöses Blut abgenommen, um den Immunglobulin-Gehalt mittels Snap-Foal-IgG-Test (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine, USA) zu bestimmen und damit die
3. Material und Methode
ausreichende Versorgung mit Immunglobulinen zu überprüfen. Lag der Gehalt unter 800 mg/dl, so wurde dem Fohlen tiefgefrorenes, gestütseigenes Kolostrum per Flasche oder per Nasenschlundsonde eingegeben und der Wert nach vier bis sechs Stunden noch einmal gemessen.
Die Desinfektion des Nabelstumpfes wurde, wie oben angegeben, vom ersten bis zum dritten Lebenstag einmal täglich durchgeführt. In den ersten sieben Tagen wurden die Fohlen täglich klinisch untersucht, danach einmal wöchentlich. Nach ca.
zehn Tagen verließen die Stuten mit ihren Fohlen den Abfohlstall.
3.1.2 Haltung der älteren Fohlen
Nachdem sie an ihrem zehnten Lebenstag den Abfohlstall verlassen hatten, wurden die Stuten mit Fohlen in Gruppen zu 8 bis 14 Paaren in überdachte, betonierte, zuvor desinfizierte und mit Stroh eingestreute Laufställe eingestallt, an die ein frei zugänglicher, ebenfalls betonierter Auslauf angeschlossen war. In den Sommermonaten (Ende April bis Oktober) wurden Stuten mit Fohlen in größeren Gruppen Tag und Nacht auf der Weide gehalten.
3.1.3 Impfung und Entwurmung
Die Fohlen wurden zum ersten Mal im Alter von 10 Tagen und dann monatlich mit wechselnden Präparaten entwurmt.
Die Stuten wurden während der Trächtigkeit gegen EHV-1 und -4 und ansonsten zweimal jährlich gegen Influenza und einmal jährlich gegen Tetanus geimpft sowie nach einem festen Entwurmungsplan ebenfalls mit verschiedenen Präparaten entwurmt.
3.2 Untersuchung der Fohlen
3.2.1 Klinische Allgemeinuntersuchung der Fohlen
Alle Fohlen wurden von der ersten bis zur 24. Lebenswoche einmal wöchentlich einer klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen. Bei dieser Untersuchung
3. Material und Methode
wurden adspektorisch Haltung, Verhalten, Fresslust, Gelenke, Kotkonsistenz sowie palpatorisch der Nabel beurteilt und die Körpertemperatur rektal gemessen.
3.2.2 Spezielle Untersuchung des Respirationstrakts
Im Rahmen der klinischen Allgemeinuntersuchung wurde ebenfalls wöchentlich eine spezielle Untersuchung des Respirationstraktes durchgeführt. Im Zuge dessen wurden das Vorhandensein, die Menge und Art des Nasenausflusses, die Größe, Konsistenz und Schmerzhaftigkeit der Lnn. mandibulares sowie auskultatorisch die Atemgeräusche der Trachea und der Lunge beurteilt und beobachtet, ob das Fohlen spontanen Husten zeigte. Die Lunge wurde auf beiden Seiten des Thorax an drei verschiedenen Stellen auskultiert und dabei auf physiologische Atemgeräusche und pathologische Nebengeräusche untersucht.
Anschließend wurden die Ergebnisse der klinischen Allgemeinuntersuchung und der speziellen Untersuchung des Respiratiostraktes in einen Befundbogen eingetragen (Tab. 12, Anhang) und anhand eines Beurteilungsbogens (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998) wurde jedem Symptom eine Punktzahl zugeordnet (Tab.
1). Die Summe der einzelnen Punkte wurde als „klinischer Score“ definiert, welcher den Schweregrad der respiratorischen Symptome in Zahlen wiedergab.
3. Material und Methode
Tab. 1: Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrades respiratorischer Symptome (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998)
Bei einem klinischen Score von 0 - 1 wird das Fohlen als lungengesund eingestuft.
Geringgradig erkrankt sind Tiere, die einen klinschen Score von 2 – 3 haben und mittelgradig diejenigen, deren klinischer Score 4 – 5 beträgt. Ein klinischer Score von über 5 besteht bei hochgradig erkrankten Probanden.
3.2.3 Hämatologische Untersuchung
Bei der wöchentlichen Untersuchung wurde jedem Fohlen aus einer Vena jugularis externa durch Punktion mit einer Kanüle (1,2 x 40 mm, BD Microlance™ 3) ca. 1 ml Blut abgenommen. Dieses wurde in einem mit EDTA di-Kaliumsalz beschichteten Probenröhrchen (KABE Labortechnik GmbH, Nümbrecht-Elsenroth) aufgefangen und anschließend die Leukozytenzahl mit Hilfe eines Blutanalysegerätes (Sysmex KX-21 N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg) nach dem elektrischen Widerstandsprinzip bestimmt.
3. Material und Methode
3.2.4 Ultrasonographische Untersuchung der Lunge
Wurde bei der klinischen Untersuchung eines Fohlens purulenter Nasenausfluss, ein pathologisches Nebengeräusch der Trachea (Rasseln) oder der Lunge (hochgradig verschärftes Vesikuläratmen, Rasseln, Giemen) oder eine Blutleukozytenzahl über 13.000 Zellen / µl festgestellt, so wurde die Lunge zusätzlich ultrasonographisch untersucht.
Die Ultraschalluntersuchung wurde mit einem tragbaren akkubetriebenen Ultraschallgerät (“Tringa L” der Fa. Piemedical/Esaote, Maastricht, Niederlande oder
“Sonovet 2000” der Fa. Kretztechnik AG, Tiefenbach, Österreich) und einem Linearscanner mit einer Frequenz von 7,5 MHz durchgeführt. Das Untersuchungsfeld erstreckte sich beidseits vom dritten bis fünfzehnten Interkostalraum und wurde kranial durch die Schultergürtelmuskulatur (M. tensor fasciae antebrachii, M. triceps brachii), dorsal durch die Stammesmuskulatur (M. longissimus dorsi) und ventral durch das Zwerchfell begrenzt.
Zur Untersuchung wurden die Fohlen am Hals und an der Hinterhand von je einem Helfer fixiert. Der Thorax wurde mit Isopropyl-Alkohol (2-Propanol 99%, Pharma-Depot GmbH, Versmold) eingesprüht und es wurde ein Transmissionsgel (BLR Sonic Ultraschallgel, Waldeck, Münster) aufgetragen. Die jeweilige Lungenhälfte wurde nun von dorsal nach ventral und von kaudal nach kranial fortlaufend untersucht. Die Befunde wurden in einen Ultraschalluntersuchungsbogen eingetragen. Zur besseren Beurteilung und Dokumentation wurde der zu untersuchende Bereich durch zwei vertikale Linien in drei Felder (A,B,C) eingeteilt (Abb. 8, Anhang). Dabei wurden rundliche, hypoechogene Veränderungen, die sich durch eine hyperechogene Grenze deutlich vom umgebenden Lungengewebe absetzten ausgemessen und ab einem Durchmesser von einem Zentimeter als Lungenabszesse angesprochen. Die Summe aller sonographisch nachgewiesenen Abszessdurchmesser ergab den
„Abszess-Score“ für das jeweilige Fohlen, der als Indikator für den Schweregrad der Lungenveränderungen diente.
3.2.5 Röntgenologische Lungenuntersuchung
Alle Fohlen der Gruppe 1 (lungengesunde Fohlen) wurden am Tag der Probengewinnung röntgenologisch untersucht.
3. Material und Methode
Bei der Anfertigung der Röntgenbilder kamen ein mobiles Röntgengerät (HF 90/20 der FA. Gierth, Riesa), eine 30 x 40 cm große Röntgenkassette (Life Ray™ medium der Fa. Ferrania, USA und X-omatic medium der Fa. Kodak, USA), eine medium Film-Folien-Kombination (Vet-X-Ray, Dunker/Einfeldt, Eckernförde) sowie ein automatisches Entwicklungssystem (1135 X-OMAT Processor, Fa. Kodak, USA) zum Einsatz.
Die Fohlen wurden ohne Sedierung im Stehen im latero-lateralen Strahlengang von beiden Seiten geröntgt. Dazu wurden sie von je einer Person an Hals und Hinterhand fixiert. Die Röntgenkassette wurde so plaziert, dass das gesamte Lungenfeld abgedeckt war.
Zur Kennzeichnung der plattennahen Thoraxseite wurde in der rechten bzw. linken oberen Ecke der Röntgenplatte ein entsprechendes Seitenzeichen angebracht. Bei einem Film-Focus-Abstand von 1,0 m wurde der Zentralstrahl ca. eine handbreit unter den Widerrist und ca. eine handbreit hinter den kaudalen Rand des M. triceps brachii plaziert. Es wurde eine kurze Belichtungszeit von 0,12 mAs gewählt, um eine Bewegungsunschärfe zu vermeiden. Die kV-Zahl variierte je nach Größe der Fohlen zwischen 78 und 90. Die Aufnahme erfolgte am Ende der Inspiration.
3.3 Probenentnahme
3.3.1 Aufnahmekriterien und Einteilung der Fohlen in Gruppen
In diese Studie wurden nur Fohlen aufgenommen, die auf dem Gestüt geboren und unter den beschriebenen Bedingungen gehalten wurden.
Es wurden zwei Fohlen-Gruppen gebildet.
Die Gruppe 1 (Kontroll-Gruppe) bestand aus 20 lungengesunden Fohlen, die folgende Voraussetzungen erfüllten:
- Fohlen, die vor der Probenentnahme bei der wöchentlichen Untersuchung einen klinischen Score von höchstens zwei haben sowie eine Blutleukozytenzahl unter 13.000 Leukozyten / µl Blut aufwiesen
- Fohlen, bei denen unmittelbar vor der Probengewinnung bei der sonographischen Lungenuntersuchung keine Abszesse festgestellt wurden
3. Material und Methode
- Fohlen, deren unmittelbar vor der Probennahme angefertigte beidseitige Röntgenbilder des Thorax keine pathologische Lungenbefunde aufwiesen
In die Gruppe 2 (Fohlen mit Lungenabszessen) wurden 44 Fohlen aufgenommen, bei denen sonographisch mindestens ein Lungenabszess mit einem Durchmesser von mindestens einem Zentimeter festgestellt wurde.
Aufgrund der Ergebnisse der Studie von WEIMAR (2006), in der bei fünf euthanasierten Fohlen desselben Betriebes der Keimgehalt pathomorphologisch nachgewiesener Lungenabszesse untersucht wurde und bei vier der fünf Tiere Rhodococcus equi (R. equi) aus dem Abszessmaterial isoliert wurde, wird das Auftreten sonographisch darstellbarer Lungenabszesse in der vorliegenden Arbeit mit einer R. equi bedingten Erkrankung gleichgesetzt.
3.3.2 Endoskopische Probenentnahme
Bei den Fohlen beider Gruppen wurden Proben des Tracheobronchialsekretes transendoskopisch entnommen. Vor Beginn der Untersuchung wurden die Fohlen mit Xylazin (Xylazin 2% Bernburg, Serumwerk Bernburg AG) in einer Dosierung von 0,6 - 1,0 mg / kg KM i.v. sediert. Sie wurden während der Bronchoskopie von je einem Helfer am Kopf und an der Hinterhand fixiert. Die Nüstern wurden mit einem feuchten Tupfer gereinigt, bevor das Endoskop von einer weiteren Person über den ventralen Nasengang in die Trachea eingeführt wurde. Dabei wurde ein 140 cm langes, flexibles Endoskop (endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Videoendoskop 138XX, Typ SG22-140, Fa. Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen) mit einem Durchmesser von 0,9 cm verwendet, welches an eine Lichtquelle (XENON 100, Fa. Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen) angeschlossen wurde. Zur Gewinnung der Sekretproben wurde zuvor durch den Arbeitskanal des Endoskops ein steriler Kunststoffkatheter eingeführt, an dessen hinterem Ende zur Sekretaspiration eine sterile, leere 20 ml Spritze (Fa. B. Braun AG, Melsungen) aufgesetzt wurde. Eine vierte Person steuerte das Endoskop und saugte das Trachoebronchialsekret über den Kunststoffkatheter in die 20 ml Spritze an. Die Optik des Endoskops konnte bei Bedarf während der Untersuchung über einen Spülkanal mit destilliertem Wasser gereinigt werden.
3. Material und Methode
Nach der Probenentnahme wurden das Endoskop und der Arbeitskanal zunächst manuell gereinigt. Die abschließende Reinigung und Desinfektion fand in einer Endoskopwaschanlage (Getinge S-1345, Schweden) statt. Als Reinigungsmittel wurde Neodisher mediclean (Dr. Weigert GmbH, Wien, Österreich) und als Desinfektionsmittel Neodisher Septo DN (Dr. Weigert GmbH, Wien, Österreich) verwendet. Die benutzten Kunststoffkatheter wurden manuell mit einer Desinfektionslösung gereinigt, mit Luftdruck getrocknet und mit einem Folienschweißgerät (Melaseal 101 comfort, Melag Apparate GmbH, Berlin) eingeschweißt. Danach wurden sie bei 1 bar für 50 min im Autoklav 23 (Melag Apparate GmbH, Berlin) autoklaviert.
3.3.3 Gewinnung der Proben der Atemluft
Im Anschluss an die Endoskopie wurden von den Fohlen beider Gruppen Proben der Atemluft gewonnen. Dazu wurden die Probanden wie bei der Endoskopie fixiert. Es wurde ihnen eine Atemmaske (Atemmaske Plexiglas mit Gummiabschluß, Fa.
Eickemeyer, Tuttlingen) über die Nüstern aufgesetzt, die zuvor mit zwei Einwegventilen versehen wurde. Das eine Ventil ermöglicht das Einströmen der Einatemluft und verhindert das Ausströmen der Ausatemluft in die Umgebung und durch das andere Ventil wird sichergestellt, dass nur ausgeatmete Luft und keine Umgebungsluft auf den Nährboden auftrifft (Abb. 1).
Diese Atemmaske wurde über eine Kunststoffverbindung luftdicht mit einem Gerät (M Air T, Millipore Air Tester, Fa. Millipore, Saint-Quentin-Yveline, France) verbunden, welches ein definiertes Volumen von 500 Litern Ausatemluft des Fohlens über die Dauer von ca. 3 Minuten ansaugte. Unmittelbar vor der Probenentnahme wurden mit Einweghandschuhen in diesen Air Tester mit Nährmedium bestückte Kassetten (M Air T Cassette, Fa. Millipore, Saint-Quentin-Yveline, France) eingesetzt, auf die die Atemluft der Fohlen direkt auftraf. Es wurde jeweils das gleiche Luftvolumen angesaugt, damit die Nährböden aller Fohlen mit der gleichen Luftmenge kontaminiert wurden. Das Ausgiessen der Kassetten mit dem entsprechenden Nährmedium erfolgte durch das Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die
3. Material und Methode
Kassetten wurden sowohl vor als auch nach der Probengewinnung gekühlt aufbewahrt und transportiert.
Nachdem eine Probe gewonnen wurde, wurden die Atemmaske und das Verbindungsstück mit kaltem Wasser ausgespült, abgetrocknet und mit 70%igem Isopropyl-Alkohol desinfiziert. Von den ersten zehn Tieren der Studie wurden hintereinander zwei Luftaspirate auf dem gleichen Nährboden gewonnen, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse darzustellen.
Für die ersten acht gesunden und die ersten 16 kranken Fohlen wurde nur ein modifiziertes Kulturmedium, der sogenannte CAZ-NB-Agar (Ceftazidim-Novobiocin-Cyclohexamid) für den Nachweis von Rhodococcus equi verwendet. Dieser Nährboden basiert auf einem Müller-Hilton-Agar und wurde nach einer in der Literatur angegebenen Rezeptur angefertigt (Tab. 7, Anhang). Die folgenden 12 gesunden und 28 kranken Probanden wurden zusätzlich auf einem Staphylokkoken-Streptokokken-Selektivnährboden (Tab. 8, Anhang) beprobt (Abb. 2).
Abb. 1: Millipore Air Tester und Atemmaske mit Verbindungsstück Millipore Air Tester
Verbindungsstück Atemmaske mit Einwegventil
3. Material und Methode
Abb. 2: M Air T Cassette mit Nährmedium
Abb. 3: Gewinnung der Proben der Atemluft
3.3.4 Kotprobenentnahme
Die Kotproben wurden mit einem rektal eingeführten sterilen Tupfer mit Nährmedium (Uni-Ter Amies CLR, Fa. MEUS S.r.l., Piove di Sacco, Italy) entnommen und zur weiteren Untersuchung ins Labor gesendet.
CAZ-NB-Agar Staphylokokken- Streptokokken-Selektivmedium
3. Material und Methode
3.3.5 Wachstumskontrolle
Um in vivo nachzuweisen, dass die verwendeten Nährböden zur Kultivierung von R. equi geeignet sind, wurde das Tracheobronchialsekret von insgesamt neun Fohlen aus Gruppe 2 (kranke Fohlen) unmittelbar nach der Entnahme auf dem Agar ausgestrichen. Drei dieser Ausstriche erfolgten nur auf dem modifizierten CAZ-NB-Agar, die restlichen sechs zusätzlich auf dem Staphylokokken-Streptokokken-Selektivnährboden. Die entnommenen Proben des Tracheobronchialsekretes wurden aus dem Kunststoffkatheter auf einen sterilen Tupfer (Uni-Ter Amies CLR, Fa. MEUS S.r.l., Piove di Sacco, Italy) gegeben und als TBS-Tupferaustrich direkt auf die Nährmedien verbracht.
Zusätzlich fand in vitro eine Wachstumskontrolle statt, die vom Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt wurde. Einmal zu Beginn der Untersuchungen wurde überprüft, dass R. equi auf den eingesetzten Nährböden (CAZ-NB-Agar und Staphylokokken-Streptokokken-Selektivnährboden) wächst. Dazu wurde ein Referenzstamm (Nr. V4822) auf die jeweiligen Nährmedien ausgestrichen und das Wachstum von Rhodococcus equi-Kolonien festgestellt.
3.3.6 Handhabung der Proben nach der Entnahme
Nach der Gewinnung wurde das Tracheobronchialsekret aus dem Kunststoffkatheter auf einen sterilen Tupfer mit Nähmedium (Uni-Ter Amies CLR, Fa. MEUS S.r.l., Piove di Sacco, Italy) aufgebracht. Zusätzlich wurde das Tracheobronchialsekret von neun Fohlen mit Lungenabszessen (Gruppe 2) auf einem CAZ-NB-Agar und von sechs dieser neun Tiere auf einem Staphylokkoken-Streptokokken-Selektivnährboden ausgestrichen. Anschließend wurden diese Tupfer, die Nährböden mit den Proben der Atemluft und die Nährböden mit den TBS-Tupferausstrichen sowie die Tupfer mit den Kotproben per Kurierdienst gekühlt an das Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover versandt.
3. Material und Methode
3.3.7 Mikrobiologische Untersuchung
Die kulturelle Untersuchung der Proben des Tracheobronchialsekrets, der Kotproben, der Proben der Atemluft und der Tupferausstriche des Tracheobronchialsekrets wurde am Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt.
Für die Anzüchtung von Rhodococcus equi aus dem Tracheobronchialsekret wurden die Tupfer, auf die das Sekret nach der Entnahme aufgebracht wurde, auf Columbia-Agar mit Schafblut (Oxoid, Wesel), Wasserblau-Metachromgelb-Laktose-Columbia-Agar nach Gassner (Oxoid, Wesel), Kochblut-Platten (Tab. 9, Anhang) und Staphylokokken-Streptokokken-Selektivnährböden ausgestrichen und zweimal fraktioniert. Alle Nährmedien, außer den Kochblut-Platten, wurden unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 35 – 37 °C für mindestens 48 Stunden in einem Brutraum inkubiert. Die Inkubation des Kochblut-Agars, der zum Nachweis mikroaerophiler Bakterien dient, erfolgte in einem speziellen CO2-Brutschrank (CO2-Auto-Zero, Heraeus Holding GmbH, Hannover-Hamburg) unter 10%iger CO2-Atmosphäre bei 35 – 37 °C für mindestens 48 Stunden. Gleichzeitig wurden Anreicherungskulturen mit Nährbouillon (Tab. 10, Anhang) angesetzt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 35 – 37 °C wurden sie wiederum auf Columbia-Agar mit Schafblut, Gassner-Platten und Staphylokokken-Streptokokken-Selektivmedium ausgestrichen und fraktioniert.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Kulturen visuell beurteilt. Kolonien mit feuchtem, zunächst transparentem, weißlichem, später rötlichem Wachstum wurden auf Columbia-Agar subkultiviert. Von den entstandenen Reinkulturen wurden Gram-Färbungen angefertigt und die Präparate mikroskopisch beurteilt. Rhodococcus ssp.
stellen sich als grampositive, pleomorphe Stäbchen dar. Zur Bestätigung des Verdachts Rhodococcus equi wurde der CAMP-Test zum Nachweis des Equi-Faktors durchgeführt. Konnte die Diagnose R. equi danach nicht eindeutig gestellt werden, wurde zusätzlich das api-Coryne-Testsystem (Fa. bio Merieux, Nürtingen) zur Absicherung der Dianose eingesetzt.
Bei der Kultivierung und der mikrobiologischen Untersuchung der Kottupfer wurde in gleicher Weise verfahren wie bei den Tupfern mit Tracheobronchialsekret.
Die Proben der Atemluft und die Tupferausstriche des Tracheobronchialsekretes wurden zunächst bei 35 – 37 °C für 48 Stunden auf den Nährböden kultiviert, auf denen sie eingesandt wurden. Anschließend wurden auch sie visuell beurteilt, bei
3. Material und Methode
Verdacht auf R. equi auf Columbia-Agar subkultiviert und weiterhin so behandelt wie die Proben des Tracheobronchialsekretes.
Die semiquantitative Beurteilung der Tupfer des Tracheobronchialsekrets und der Kottupfer wurde mittels des fraktionierten Ausstrichs vorgenommen. Dazu wurde der Tupfer auf einem Drittel des jeweiligen Nährbodens ausgestrichen. Anschließend wurde in einem weiteren Drittel mit einer heißen Öse ein zweiter Impfstrich aus dem Tupferausstrich und im letzten Drittel eine dritte Fraktionierung aus dem zweiten Impfstrich angefertigt. Wenn nur in der ersten Fraktion ein Wachstum feststellbar war, handelte es sich um ein geringradiges Keimwachstum. War der Keim in der ersten und zweiten Fraktionierung sichtbar, war der Erregergehalt mittelgradig und falls er in allen drei Fraktionen vorhanden war hochgradig. Auf den Nährböden der Proben der Atemluft und auf denen, wo direkt ein Ausstrich des TBS-Tupfers angefertigt wurde, wurde der Keimgehalt anhand der gewachsenen Kolonien semiquantitativ beurteilt. Einzelne Kolonien gaben ein geringradiges, 20 - 50 Kolonien ein mittelgradiges und über 50 Kolonien ein hochgradiges Erregerwachstum an.
3. Material und Methode
3.3.8 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Die statistischen Auswertungen der Ergebnisse wurden von Herrn Dr. W. Reimers (Adendorf) mit Hilfe des Programmpakets STATISTICA (Fa. StatSoft Inc., Tulsa, USA) durchgeführt. Die Bewertung der statistischen Tests und damit die Darstellung der Signifikanz erfolgten anhand der Irrtumswahrscheinlichkeit p (Tab. 2).
Tab. 2: Darstellung der Signifikanz anhand der Irrtumswahrscheinlichkeit (p-Wert)
p-Wert Signifikanz Symbol
p > 0,05 nicht signifikant
p < 0,05 schwach signifikant *
p < 0,01 signifikant **
p < 0,001 hoch signifikant ***
Folgende Punkte wurden bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse betrachtet:
1. Zunächst erfolgte die deskriptive Darstellung der Daten für die stetigen Variablen, das heißt für intervallskalierte und rangskalierte Variablen. Für jede Fohlengruppe wurden die Anzahl der Tiere, der arithmetische Mittelwert und
1. Zunächst erfolgte die deskriptive Darstellung der Daten für die stetigen Variablen, das heißt für intervallskalierte und rangskalierte Variablen. Für jede Fohlengruppe wurden die Anzahl der Tiere, der arithmetische Mittelwert und