3.3.1 Aufnahmekriterien und Einteilung der Fohlen in Gruppen
In diese Studie wurden nur Fohlen aufgenommen, die auf dem Gestüt geboren und unter den beschriebenen Bedingungen gehalten wurden.
Es wurden zwei Fohlen-Gruppen gebildet.
Die Gruppe 1 (Kontroll-Gruppe) bestand aus 20 lungengesunden Fohlen, die folgende Voraussetzungen erfüllten:
- Fohlen, die vor der Probenentnahme bei der wöchentlichen Untersuchung einen klinischen Score von höchstens zwei haben sowie eine Blutleukozytenzahl unter 13.000 Leukozyten / µl Blut aufwiesen
- Fohlen, bei denen unmittelbar vor der Probengewinnung bei der sonographischen Lungenuntersuchung keine Abszesse festgestellt wurden
3. Material und Methode
- Fohlen, deren unmittelbar vor der Probennahme angefertigte beidseitige Röntgenbilder des Thorax keine pathologische Lungenbefunde aufwiesen
In die Gruppe 2 (Fohlen mit Lungenabszessen) wurden 44 Fohlen aufgenommen, bei denen sonographisch mindestens ein Lungenabszess mit einem Durchmesser von mindestens einem Zentimeter festgestellt wurde.
Aufgrund der Ergebnisse der Studie von WEIMAR (2006), in der bei fünf euthanasierten Fohlen desselben Betriebes der Keimgehalt pathomorphologisch nachgewiesener Lungenabszesse untersucht wurde und bei vier der fünf Tiere Rhodococcus equi (R. equi) aus dem Abszessmaterial isoliert wurde, wird das Auftreten sonographisch darstellbarer Lungenabszesse in der vorliegenden Arbeit mit einer R. equi bedingten Erkrankung gleichgesetzt.
3.3.2 Endoskopische Probenentnahme
Bei den Fohlen beider Gruppen wurden Proben des Tracheobronchialsekretes transendoskopisch entnommen. Vor Beginn der Untersuchung wurden die Fohlen mit Xylazin (Xylazin 2% Bernburg, Serumwerk Bernburg AG) in einer Dosierung von 0,6 - 1,0 mg / kg KM i.v. sediert. Sie wurden während der Bronchoskopie von je einem Helfer am Kopf und an der Hinterhand fixiert. Die Nüstern wurden mit einem feuchten Tupfer gereinigt, bevor das Endoskop von einer weiteren Person über den ventralen Nasengang in die Trachea eingeführt wurde. Dabei wurde ein 140 cm langes, flexibles Endoskop (endoskopische Videoeinheit Tel Pack, Videoendoskop 138XX, Typ SG22-140, Fa. Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen) mit einem Durchmesser von 0,9 cm verwendet, welches an eine Lichtquelle (XENON 100, Fa. Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen) angeschlossen wurde. Zur Gewinnung der Sekretproben wurde zuvor durch den Arbeitskanal des Endoskops ein steriler Kunststoffkatheter eingeführt, an dessen hinterem Ende zur Sekretaspiration eine sterile, leere 20 ml Spritze (Fa. B. Braun AG, Melsungen) aufgesetzt wurde. Eine vierte Person steuerte das Endoskop und saugte das Trachoebronchialsekret über den Kunststoffkatheter in die 20 ml Spritze an. Die Optik des Endoskops konnte bei Bedarf während der Untersuchung über einen Spülkanal mit destilliertem Wasser gereinigt werden.
3. Material und Methode
Nach der Probenentnahme wurden das Endoskop und der Arbeitskanal zunächst manuell gereinigt. Die abschließende Reinigung und Desinfektion fand in einer Endoskopwaschanlage (Getinge S-1345, Schweden) statt. Als Reinigungsmittel wurde Neodisher mediclean (Dr. Weigert GmbH, Wien, Österreich) und als Desinfektionsmittel Neodisher Septo DN (Dr. Weigert GmbH, Wien, Österreich) verwendet. Die benutzten Kunststoffkatheter wurden manuell mit einer Desinfektionslösung gereinigt, mit Luftdruck getrocknet und mit einem Folienschweißgerät (Melaseal 101 comfort, Melag Apparate GmbH, Berlin) eingeschweißt. Danach wurden sie bei 1 bar für 50 min im Autoklav 23 (Melag Apparate GmbH, Berlin) autoklaviert.
3.3.3 Gewinnung der Proben der Atemluft
Im Anschluss an die Endoskopie wurden von den Fohlen beider Gruppen Proben der Atemluft gewonnen. Dazu wurden die Probanden wie bei der Endoskopie fixiert. Es wurde ihnen eine Atemmaske (Atemmaske Plexiglas mit Gummiabschluß, Fa.
Eickemeyer, Tuttlingen) über die Nüstern aufgesetzt, die zuvor mit zwei Einwegventilen versehen wurde. Das eine Ventil ermöglicht das Einströmen der Einatemluft und verhindert das Ausströmen der Ausatemluft in die Umgebung und durch das andere Ventil wird sichergestellt, dass nur ausgeatmete Luft und keine Umgebungsluft auf den Nährboden auftrifft (Abb. 1).
Diese Atemmaske wurde über eine Kunststoffverbindung luftdicht mit einem Gerät (M Air T, Millipore Air Tester, Fa. Millipore, Saint-Quentin-Yveline, France) verbunden, welches ein definiertes Volumen von 500 Litern Ausatemluft des Fohlens über die Dauer von ca. 3 Minuten ansaugte. Unmittelbar vor der Probenentnahme wurden mit Einweghandschuhen in diesen Air Tester mit Nährmedium bestückte Kassetten (M Air T Cassette, Fa. Millipore, Saint-Quentin-Yveline, France) eingesetzt, auf die die Atemluft der Fohlen direkt auftraf. Es wurde jeweils das gleiche Luftvolumen angesaugt, damit die Nährböden aller Fohlen mit der gleichen Luftmenge kontaminiert wurden. Das Ausgiessen der Kassetten mit dem entsprechenden Nährmedium erfolgte durch das Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die
3. Material und Methode
Kassetten wurden sowohl vor als auch nach der Probengewinnung gekühlt aufbewahrt und transportiert.
Nachdem eine Probe gewonnen wurde, wurden die Atemmaske und das Verbindungsstück mit kaltem Wasser ausgespült, abgetrocknet und mit 70%igem Isopropyl-Alkohol desinfiziert. Von den ersten zehn Tieren der Studie wurden hintereinander zwei Luftaspirate auf dem gleichen Nährboden gewonnen, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse darzustellen.
Für die ersten acht gesunden und die ersten 16 kranken Fohlen wurde nur ein modifiziertes Kulturmedium, der sogenannte CAZ-NB-Agar (Ceftazidim-Novobiocin-Cyclohexamid) für den Nachweis von Rhodococcus equi verwendet. Dieser Nährboden basiert auf einem Müller-Hilton-Agar und wurde nach einer in der Literatur angegebenen Rezeptur angefertigt (Tab. 7, Anhang). Die folgenden 12 gesunden und 28 kranken Probanden wurden zusätzlich auf einem Staphylokkoken-Streptokokken-Selektivnährboden (Tab. 8, Anhang) beprobt (Abb. 2).
Abb. 1: Millipore Air Tester und Atemmaske mit Verbindungsstück Millipore Air Tester
Verbindungsstück Atemmaske mit Einwegventil
3. Material und Methode
Abb. 2: M Air T Cassette mit Nährmedium
Abb. 3: Gewinnung der Proben der Atemluft
3.3.4 Kotprobenentnahme
Die Kotproben wurden mit einem rektal eingeführten sterilen Tupfer mit Nährmedium (Uni-Ter Amies CLR, Fa. MEUS S.r.l., Piove di Sacco, Italy) entnommen und zur weiteren Untersuchung ins Labor gesendet.
CAZ-NB-Agar Staphylokokken- Streptokokken-Selektivmedium
3. Material und Methode
3.3.5 Wachstumskontrolle
Um in vivo nachzuweisen, dass die verwendeten Nährböden zur Kultivierung von R. equi geeignet sind, wurde das Tracheobronchialsekret von insgesamt neun Fohlen aus Gruppe 2 (kranke Fohlen) unmittelbar nach der Entnahme auf dem Agar ausgestrichen. Drei dieser Ausstriche erfolgten nur auf dem modifizierten CAZ-NB-Agar, die restlichen sechs zusätzlich auf dem Staphylokokken-Streptokokken-Selektivnährboden. Die entnommenen Proben des Tracheobronchialsekretes wurden aus dem Kunststoffkatheter auf einen sterilen Tupfer (Uni-Ter Amies CLR, Fa. MEUS S.r.l., Piove di Sacco, Italy) gegeben und als TBS-Tupferaustrich direkt auf die Nährmedien verbracht.
Zusätzlich fand in vitro eine Wachstumskontrolle statt, die vom Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt wurde. Einmal zu Beginn der Untersuchungen wurde überprüft, dass R. equi auf den eingesetzten Nährböden (CAZ-NB-Agar und Staphylokokken-Streptokokken-Selektivnährboden) wächst. Dazu wurde ein Referenzstamm (Nr. V4822) auf die jeweiligen Nährmedien ausgestrichen und das Wachstum von Rhodococcus equi-Kolonien festgestellt.
3.3.6 Handhabung der Proben nach der Entnahme
Nach der Gewinnung wurde das Tracheobronchialsekret aus dem Kunststoffkatheter auf einen sterilen Tupfer mit Nähmedium (Uni-Ter Amies CLR, Fa. MEUS S.r.l., Piove di Sacco, Italy) aufgebracht. Zusätzlich wurde das Tracheobronchialsekret von neun Fohlen mit Lungenabszessen (Gruppe 2) auf einem CAZ-NB-Agar und von sechs dieser neun Tiere auf einem Staphylokkoken-Streptokokken-Selektivnährboden ausgestrichen. Anschließend wurden diese Tupfer, die Nährböden mit den Proben der Atemluft und die Nährböden mit den TBS-Tupferausstrichen sowie die Tupfer mit den Kotproben per Kurierdienst gekühlt an das Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover versandt.
3. Material und Methode
3.3.7 Mikrobiologische Untersuchung
Die kulturelle Untersuchung der Proben des Tracheobronchialsekrets, der Kotproben, der Proben der Atemluft und der Tupferausstriche des Tracheobronchialsekrets wurde am Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt.
Für die Anzüchtung von Rhodococcus equi aus dem Tracheobronchialsekret wurden die Tupfer, auf die das Sekret nach der Entnahme aufgebracht wurde, auf Columbia-Agar mit Schafblut (Oxoid, Wesel), Wasserblau-Metachromgelb-Laktose-Columbia-Agar nach Gassner (Oxoid, Wesel), Kochblut-Platten (Tab. 9, Anhang) und Staphylokokken-Streptokokken-Selektivnährböden ausgestrichen und zweimal fraktioniert. Alle Nährmedien, außer den Kochblut-Platten, wurden unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 35 – 37 °C für mindestens 48 Stunden in einem Brutraum inkubiert. Die Inkubation des Kochblut-Agars, der zum Nachweis mikroaerophiler Bakterien dient, erfolgte in einem speziellen CO2-Brutschrank (CO2-Auto-Zero, Heraeus Holding GmbH, Hannover-Hamburg) unter 10%iger CO2-Atmosphäre bei 35 – 37 °C für mindestens 48 Stunden. Gleichzeitig wurden Anreicherungskulturen mit Nährbouillon (Tab. 10, Anhang) angesetzt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 35 – 37 °C wurden sie wiederum auf Columbia-Agar mit Schafblut, Gassner-Platten und Staphylokokken-Streptokokken-Selektivmedium ausgestrichen und fraktioniert.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Kulturen visuell beurteilt. Kolonien mit feuchtem, zunächst transparentem, weißlichem, später rötlichem Wachstum wurden auf Columbia-Agar subkultiviert. Von den entstandenen Reinkulturen wurden Gram-Färbungen angefertigt und die Präparate mikroskopisch beurteilt. Rhodococcus ssp.
stellen sich als grampositive, pleomorphe Stäbchen dar. Zur Bestätigung des Verdachts Rhodococcus equi wurde der CAMP-Test zum Nachweis des Equi-Faktors durchgeführt. Konnte die Diagnose R. equi danach nicht eindeutig gestellt werden, wurde zusätzlich das api-Coryne-Testsystem (Fa. bio Merieux, Nürtingen) zur Absicherung der Dianose eingesetzt.
Bei der Kultivierung und der mikrobiologischen Untersuchung der Kottupfer wurde in gleicher Weise verfahren wie bei den Tupfern mit Tracheobronchialsekret.
Die Proben der Atemluft und die Tupferausstriche des Tracheobronchialsekretes wurden zunächst bei 35 – 37 °C für 48 Stunden auf den Nährböden kultiviert, auf denen sie eingesandt wurden. Anschließend wurden auch sie visuell beurteilt, bei
3. Material und Methode
Verdacht auf R. equi auf Columbia-Agar subkultiviert und weiterhin so behandelt wie die Proben des Tracheobronchialsekretes.
Die semiquantitative Beurteilung der Tupfer des Tracheobronchialsekrets und der Kottupfer wurde mittels des fraktionierten Ausstrichs vorgenommen. Dazu wurde der Tupfer auf einem Drittel des jeweiligen Nährbodens ausgestrichen. Anschließend wurde in einem weiteren Drittel mit einer heißen Öse ein zweiter Impfstrich aus dem Tupferausstrich und im letzten Drittel eine dritte Fraktionierung aus dem zweiten Impfstrich angefertigt. Wenn nur in der ersten Fraktion ein Wachstum feststellbar war, handelte es sich um ein geringradiges Keimwachstum. War der Keim in der ersten und zweiten Fraktionierung sichtbar, war der Erregergehalt mittelgradig und falls er in allen drei Fraktionen vorhanden war hochgradig. Auf den Nährböden der Proben der Atemluft und auf denen, wo direkt ein Ausstrich des TBS-Tupfers angefertigt wurde, wurde der Keimgehalt anhand der gewachsenen Kolonien semiquantitativ beurteilt. Einzelne Kolonien gaben ein geringradiges, 20 - 50 Kolonien ein mittelgradiges und über 50 Kolonien ein hochgradiges Erregerwachstum an.
3. Material und Methode
3.3.8 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Die statistischen Auswertungen der Ergebnisse wurden von Herrn Dr. W. Reimers (Adendorf) mit Hilfe des Programmpakets STATISTICA (Fa. StatSoft Inc., Tulsa, USA) durchgeführt. Die Bewertung der statistischen Tests und damit die Darstellung der Signifikanz erfolgten anhand der Irrtumswahrscheinlichkeit p (Tab. 2).
Tab. 2: Darstellung der Signifikanz anhand der Irrtumswahrscheinlichkeit (p-Wert)
p-Wert Signifikanz Symbol
p > 0,05 nicht signifikant
p < 0,05 schwach signifikant *
p < 0,01 signifikant **
p < 0,001 hoch signifikant ***
Folgende Punkte wurden bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse betrachtet:
1. Zunächst erfolgte die deskriptive Darstellung der Daten für die stetigen Variablen, das heißt für intervallskalierte und rangskalierte Variablen. Für jede Fohlengruppe wurden die Anzahl der Tiere, der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung bzw. der Median, die Minima und Maxima, das obere und untere Quartil der Untersuchungsparameter ermittelt.
2. Es folgte der Vergleich beider Studiengruppen hinsichtlich der Parameter Alter, klinischer Score, Abszess-Score und Leukozytenzahl im Blut der Probanden mittels Mann-Whitney-U-Test.
3. Der Vergleich beider Fohlengruppen hinsichtlich der Geschlechterverteilung erfolgte mittels Fisher-Test.
4. Weiterhin wurde der Zusammenhang der Parameter klinischer Score, Abszess-Score und Leukozytenzahl mit den Ergebnissen der Proben des Tracheobronchialsekretes und der Kotproben in Gruppe 1 und 2 durch die Anwendung des Spearman´schen Rangkorrelationskoeffizienten R geprüft.
Es gilt: R-Wert bis ± 0,32 → schwacher Zusammenhang R-Wert bis ± 0,71 → deutlicher Zusammenhang
3. Material und Methode
R-Wert > 0,71 → sehr deutlicher Zusammenhang R-Wert = 1,0 → gesetzmäßiger Zusammenhang
5. Mittels des Spearman´schen Rangkorrelationskoeffizienten R wurde auch der Zusammenhang der Ergebnisse der TBS-Tupferausstriche auf CAZ-NB-Agar und auf Staphylokokken-Streptokokken-Selektivnährboden mit den Ergebnissen der Proben des Tracheobronchialsekrets und der Kotproben in Gruppe 2 (Fohlen mit Lungenabszessen) ermittelt.
6. Die Unterschiede zwischen den Ergebnissen der TBS-Tupferausstriche auf CAZ-NB-Agar und auf Staphylokokken-Streptokokken-Selektivnährboden wurden mittels des Wilcoxon-Tests für Paardifferenzen ermittelt.
7. Die Spezifität und die Sensitivität der jeweiligen Nachweisverfahren wurden anhand der folgenden Formeln errechnet:
Spezifität = richtig negative : (richtig negative + falsch positive)
Spezifität: gibt an, mit welcher Sicherheit ein Test das Vorhandensein einer Krankheit ausschließen kann
Sensitivität = richtig positive : (richtig positive + falsch negative)
Sensitivität: gibt Auskunft über die Fähigkeit eines Testes kranke Tiere innerhalb einer Population erkennen zu können
4. Ergebnisse