Visualisierung von EibG mit humanem IgG Fc-HRP

Die Visualisierung von EibG und seinen Subtypen erforderte eine aufwändige und relativ langwierige Optimierung der SDS-PAGE – Parameter und des Proteinblotverfahrens. Unterschiedliche oligomere Formen von EibG und insbesondere die Hydrophobizität dieses Membranproteins erschwerten die Analyse, für die standardisierte Gelelektrophorese-Bedingungen. Da am Anfang dieser Arbeit noch nichts über die oligomere Formen von EibG bekannt war, mussten zunächst die optimalen Konzentrationen der Lysate, der Trennbereich für die SDS-PAGE, eine geeignete Trägermembran und die Parameter für das Blotting-Verfahren ermittelt werden. Sequenzierungsdaten ergaben für EibG das Fehlen von Cystein und damit die Ausschließung von Disulfidbrücken. Auf den Einsatz von reduzierenden Agenzien wurde aber trotzdem nicht verzichtet, da die reduktive Spaltung von Fremdproteinen eine bessere Trennung der EibG-Proteine ermöglichte. Die Detektion von EibG erfolgte auf der Blotmembran (Nitrocellulose) mittels humanem IgG Fc-HRP. Da das immobilisierte EibG-Protein den Antikörper über den Fc-Teil bindet und der Antikörper selbst nicht gegen das zu detektierende Protein gerichtet ist, musste die Bindungszeit beim Western-Blot von üblicherweise einer bis zwei Stunden auf über 16 h ausgedehnt werden. Um eine möglichst hohe Affinität von EibG zu IgG Fc zu gewährleisten, mussten die optimalen Inkubationsparameter (Pufferzusammensetzung, Einsatz von Detergenzien, Waschlösung und Waschdauer, Konzentrationen von IgG Fc-HRP, etc.) ebenfalls erst noch ermittelt werden.

Abb. 50 zeigt den mittels Western-Blot geführten Nachweis von EibG des WT-Stammes 1809/00 und des Klons B-1-10 mit identischem eibG-α – Allel (eibG-001) auf einer Nitrocellulosemembran.

Die E. coli – Lysate wurden mit und ohne (*) reduzierendem Agenz (2-Mercaptoethanol) im Probenpuffer auf 100 °C bzw. 60 °C (*) erhitzt und auf ein 10%iges SDS-PAGE – Gel aufgetragen.

Während die Zugabe von 2-Mercaptoethanol sowohl beim WT-Stamm als auch beim Klon eine Tetramerisierung von EibG (die durch DNA-Sequenzierung bestimmte Monomergröße betrug 54 kDa) zur Folge hat (ca. 200 kDa), bewirken der Verzicht auf 2-Mercaptoethanol und das Erhitzen auf nur 60 °C die Beibehaltung der nativen trimeren Form (ca. 150 kDa). Zusätzlich wird beim Wildtyp unter nicht-reduzierenden Bedingungen eine hochmolekulare oligomere Form von EibG detektiert, dessen Größe aber nicht genau bestimmt werden konnte, da dieses Oligomer nur wenig in das Gel einwanderte und somit außerhalb der Skala des mitgeführten Molekulargewichtmarkers lag.

Das Aufkochen EibG-haltiger Lysate unter reduzierenden Bedingungen bewirkt anscheinend die Dissoziation der trimeren Form von EibG, welches sich während der Gelelektrophorese wieder zur dimeren und/oder tetrameren Form zusammenlagert. Die Erhitzung der Lysate auf lediglich 60 °C bewirkt eine ausreichend gute Dissoziation von Fremdproteinen; außerdem unterscheidet sich das Laufverhalten von EibG nach milder Erhitzung nur wenig von den auf 100 °C erhitzten Proben (vgl. die trimere EibG-Form des WT-Stammes 1809/00 in beiden Spuren). Bei 60 °C konnte also im Falle des WT-Stammes 1809/00 kein Aufbrechen der trimeren EibG-Form erreicht werden, weshalb es sich nicht wieder zu Dimeren oder Tetrameren zusammenlagern konnte; unter diesen Bedingungen konnte die oligomere EibG-Form ebenfalls nicht dissoziieren. Aufgrund stark hydrophober Bereiche am C-terminalen Ende von EibG erfolgt nach dem Aufbrechen der bakteriellen Membran und der Freisetzung von EibG in den Lysispuffer eine mizellenartige Zusammenlagerung der EibG-Moleküle.

Diese hochmolekulare Struktur ist sehr stabil und wird erst durch Aufkochen bei 100 °C aufgelöst und bleibt nach sofortiger Auftragung auf das GE-Gel destabilisiert.

Abb. 50: Visualisierung von EibG des Wildtypstammes 1809/00 (eibG-α, Allel 001) und des Klons B-1-10 (eibG-α, Allel 001) mit humanem IgG Fc-HRP.

Lysate der beiden Stämme in Probepuffer mit und ohne (*) reduzierende Agenzien wurden auf 100 °C bzw. 60 °C (*) erhitzt und die Proteinmischungen mittels SDS-PAGE aufgetrennt.

Durch IPTG-Induktion des eibG-Gens erfolgt eine hohe Expression von EibG-Monomeren beim Klon B-1-10. Der Transfer von EibG auf die Membranaußenseite wird durch das sec-System limitiert,

sodass nur eine begrenzte Menge an tri- bzw. tetrameren Formen von EibG auf der Membranaußenseite gebildet wird. Die synthetisierten EibG-Monomere akkumulieren daher im Zellinneren und stellen die Hauptkomponente in der SDS-PAGE (vgl. beide Spuren der B-1-10 – Lysate). Das Aufkochen der Lysate bei 100 °C bewirkt, ähnlich wie beim Wildtyp, eine erhöhte Bildung der tetrameren Form von EibG. Die Behandlung bei 60 °C belässt das EibG in seiner trimeren Form, und diese oligomere Form von EibG wird ebenfalls ähnlich wie beim Wildtyp nicht zerstört.

Zusätzlich tritt sporadisch eine gefärbte Bande im Bereich von 30 bis 37 kDa auf, die das IgG Fc-HRP darstellt (vgl. beide Spuren von B-1-10). Durch die Hitzelyse der Zellen kommt es zum Abbruch der Assemblierung der EibG-Trimere auf der Bakterienoberfläche, wodurch die EibG-Transmembran-domäne vom restlichen Protein abgetrennt wird und im SDS-PAGE – Probenpuffer weiter dissoziiert.

Das 54 kDa große EibG wird bei diesem Prozess etwa in seiner Mitte gespalten, wodurch es zur Detektion von Abbruchfragmenten kommt.

4.6.2 1D-GE eibG-positiver Wildtypstämme

Ziel der Experimente war es, die EibG-Expression in verschiedenen WT-Stämmen nachzuweisen.

Hierfür wurden die geschüttelten ÜN-Kulturen von 20 eibG-positiven STEC mittels OD630-Messung auf die gleiche Zellzahl eingestellt, Aliquots im Probenpuffer bei 100 °C aufgekocht und identische Volumina per SDS-PAGE aufgetrennt. Die Coomassie-gefärbten Gele und der immunchemische Nachweis von EibG mit humanem IgG Fc-HRP sind in Abb. 51 dargestellt.

Es zeigt sich, dass in Schüttelkultur die 20 verschiedenen eibG-positiven STEC unterschiedliche EibG-Mengen exprimieren. Da es sich hier um die Auftragung von Bakterienlysaten ohne jegliche Proteinaufreinigung handelt, sind die detektierten IgG Fc – bindenden Proteine als die Gesamtheit antikörperbindender Moleküle nach ÜN-Kultivierung anzusehen. Diese „Momentaufnahme“ zeigt, dass unabhängig vom eibG-Allel oder Subtyp die verschiedenen E. coli – Serotypen unterschiedliche Mengen an EibG exprimieren. Die Serotypen mit den höchsten detektierten EibG-Mengen sind Ont:H^-, O91:H^-, OR:H^-, O91:Hnt und O91:H14. Die niedrigsten EibG-Mengen wurden in diesem Versuch bei den Serotypen O91:H14, OR:H10, OR:H45, O146:H21, O91:H^-, OR:H14, O146:H28, Ont:H30 und OR:H21 detektiert. Ein mittlerer EibG-Gehalt konnte bei den Serotypen OR:H45, OR:Hnt, Ont:H^- und O152:H^- nachgewiesen werden. Obwohl nur eine kleine Kollektion verschiedener Serotypen untersucht wurde, fällt auf, dass mehr EibG pro Bakterienzelle von den E. coli – Serotypen mit fehlenden oder nicht typisierbaren Flagellen exprimiert wird als von Serotypen mit nachweisbaren H-Antigenen. Eine eingeschränkte Mobilität von E. coli durch eine verringerte Expression oder das Fehlen von Flagellen scheint die Expression von nichtfimbriellen Adhäsinen wie EibG bei geschüttelter Kultivierung zu begünstigen.

Diese Ergebnisse bestärken die schon in den Kapiteln 4.2.1 und 4.5.5 beschriebenen Ergebnissen, dass das Fehlen der Flagellen die Adhäsion von E. coli an Oberflächen begünstigt und die Ausbildung längerer Ketten zur Folge hat. Die Expression von EibG wird durch den Verlust an Mobilität bei H^-- oder Hnt-Stämmen verstärkt und führt schließlich zu erhöhtem Zell-Zell-Kontakt und einer damit einhergehenden erhöhten Biofilmausbildung.

Abb. 51: Expression von EibG in verschiedenen eibG-positiven Wildtypstämmen.

SDS-PAGE – Gele (A und B) und Immunblots (C und D) von Lysaten folgender Stämme sind in den Teilabbildungen A bis D dargestellt: von links nach rechts: (1) 1809/00 (O91:H14 [H14], eibG-α); (2) 3558/96 (Ont:H^- [H14], eibG-α); (3) 99-02787 (OR:H10, eibG-α); (4) 7140/96 (O91:H^- [H14], eibG-α); (5) 172/98 (OR:H^- [H14], eibG-α); (6) 393/98 (O91:H^- [H14], eibG-α);

(7) 4798/97 (O91:Hnt [H14], eibG-α); (8) 4831/97 (OR:H45, eibG-α); (9) 6451/98 (OR:H45, eibG-α); (10) 4789/97-1 (O146:H21, eibG-α); (11) 4884/97 (OR:Hnt [H14], eibG-α); (12) 2875/96 (O91:H14 [H14], eibG-α); (13) 3671/97 (O91:H^- [H14], eibG-α); (14) 6705/95 (OR:H14 [H14], eibG-α); (15) 6561/95 (Ont:H^- [H14], eibG-α); (16) 01/E243 (O91:H^- [H14], eibG-α); (17) ST234 (O146:H28, eibG-α); (18) 0520/99 (Ont:H30, eibG-γ); (19) 4141/96 (OR:H21, eibG-α); (20) 06-03233 (O152:H^- [H14], eibG-β). Detektion in (A und B): Coomassie; Detektion in (C und D): humanes IgG Fc-HRP.

4.6.3 Einfluss von geschüttelter und stationärer Kultivierung auf die EibG-Expression und