Konzentrierung von Proteingemischen

Die aus den Zellaufschluss-Experimenten stammenden Proteinlösungen lagen häufig in hohen Verdünnungen vor, die vor weiterer Aufarbeitung aufkonzentriert werden mussten. Hierfür wurden mehrere Proteinfällungsmethoden getestet. Als Ziel dieser Experimente galt es eine Methode zu finden, bei der EibG effizient und im aktiven Zustand aufkonzentriert werden kann, so dass das Protein seine Fähigkeit zur Bindung von IgG nicht verliert. Im Anschluss erfolgte immer eine Überprüfung der konzentrierten Proteinfraktionen durch SDS-PAGE und weiter durch den Westernblot (Kapitel 3.6.4).

Proteinfällung

Die im Folgenden beschriebenen Methoden basieren auf dem Einsatz von Chemikalien, die die Wasserstoffbrückenbindungen der Proteine destabilisieren und somit die Löslichkeit der Proteine in Wasser herabsetzen, was zu deren Präzipitation führt.

1. Aceton-Fällung (Scopes, 1994):

 Zu 200 µL proteinhaltiger Probe wurden 800 µL eiskaltes Aceton hinzu gegeben und 1 h bei -20 °C inkubiert

 Die Zentrifugation der gefällten Proteine erfolgte bei 14000 g und 4 °C für 5 min

 Das Präzipitat wurde dann in 20 bis 50 µL große Aliquots (abhängig von der gewünschten Konzentration) ddH2O bzw. TBS gelöst und wurde bei -20 °C bis zur weiteren Untersuchung gelagert werden

2. TCA-Fällung (Polacheck und Cabib, 1981):

 Die Probe wurde 1:1 mit 10% (v/v) TCA (trichloroacetic acid, Trichloressigsäure) vermischt und für 1 h auf Eis inkubiert

 Zentrifugation erfolgte bei 14000 g und 4 °C für 5 min

 Das Sediment wurde dann in 70%igem (v/v) Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert

 Das Präzipitat wurde dann im gewünschten Volumen an TBS aufgenommen und bis zur Untersuchung eingefroren

3. Ammoniumsulfat (Englard und Seifter, 1990):

 Zehn Teile der Probe wurden mit einem Teil 1 mol/L Tris-HCl vermischt, wodurch eine pH-Stabilität im neutralen Bereich gewährleistet wurde

 Eine gesättigte Lösung Ammoniumsulfat wurde in Verhältnissen von 1:1, 4:1 und 1:4 zu der Proteinlösung tropfenweise hinzu gegeben (25% (w/v), 50% (w/v) bzw. 75%

(w/v) Sättigung) und 1 h auf Eis bzw. ÜN auf Eis bei 4 °C inkubiert

 Zentrifugation erfolgte bei 10000 g und 4 °C für 20 min

 Das Präzipitat wurde dann wieder in der Lösung an Ammoniumsulfat in TBS gelöst, welche für die Fällung verwendet wurde. Es folgte erneute Zentrifugation

 Sowohl der Überstand (nicht gefällte Proteine) als auch das Sediment (gefällte Proteine) wurden auf ihren Gehalt an EibG untersucht.

Mechanische Proteinkonzentrierung

Da die Proteinpräzipitate teilweise noch hohe Salzkonzentrationen aufwiesen und diese die Untersuchungen mit SDS-PAGE stören, wurden die Suspensionen mit kommerziell erhältlichen Ultrafiltrationseinheiten (UF) entsalzt und weiter aufkonzentriert. Die Lösungen mit Volumina bis 20 mL wurden mit den Vivaspin 6 bzw. Vivaspin 20 der Firma Sartorius Stedim mit unterschiedlicher Ausschlussgrenze (NMWC: nominal molecular weight cut-off) von 3, 10, 30, 50 bzw. 100 kDa (Kilodalton) aufgearbeitet. Hierbei handelt es sich um aus zwei Hauptteilen bestehende UF-Reaktionsgefäße: dem oberen Reservoir mit der Polyethersulfon-Membran am Boden sowie aus dem darunter aufzubringenden Behälter für das Permeat. Durch die Zentrifugalkräfte wird beim Einsatz der UF-Einheiten die zu entsalzende Lösung durch die Membran gepresst und die nicht-löslichen Komponenten werden aufgrund ihrer Molekularmasse im oberen Reservoir zurückgehalten bzw.

wandern durch die Membran in den unteren Auffangbehälter. Die hierfür eingesetzte Zentrifuge der Firma Hettich, Rotana 480 RS, wurde mit verschiedenen Rotoren für die verschiedenen Größen der UF-Einheiten betrieben.

Für Volumina unter 1 mL wurden die Zentrifugen-Filtereinheiten der Firma Millipore mit der Low-binding Durapore® PVDF – Membran mit variablem NMWC eingesetzt. Diese funktionieren nach dem gleichen Prinzip wie die Vivaspin-Einheiten.

Für Volumina größer als 100 mL wurde die Ultrafiltrationseinheit Vivaflow 200 der Firma Sartorius verwendet, die aus einer Doppelkammer mit dazwischen liegender Membran aus Polyethersulfon (NMWC: 100 kDa) mit 200 cm² Membranfläche besteht. Die Filtration erfolgt nach dem Prinzip des Querstroms bzw. Tangentialflusses, wobei die zu filtrierende Lösung mittels einer Peristaltikpumpe in die erste Kammer der Einheit gedrückt wird. Das Filtrat wird auf der anderen Seite der Membran aufgefangen, wieder zurück in das Probengefäß geleitet und kann erneut durch die UF-Einheit geleitet werden. In Abb. 15 ist der Aufbau einer Vivaflow 200 – Einheit schematisch dargestellt.

Abb. 15: Das Vivaflow 200 – System für die Ultrafiltration nach dem Querstromprinzip (crossflow).

Alle Experimente mit Vivaflow 200 wurden gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt.

3.6.3 Proteinkonzentrationsbestimmung NanoDrop-Schnelltest

Um die im Folgenden beschriebenen kolorimetrischen Proteinkonzentrationsbestimmungen genauer und schneller durchführen zu können, wurden proteinhaltige Proben erst mittels einer spektroskopischen Methode auf die gewünschten Proteinkonzentrationen eingestellt. Es wurden 2 µL der jeweiligen Probe mit dem NanoDrop bei 280 nm vermessen, womit die ungefähren Konzentrationen an Protein bestimmt wurden.

Markwell-Assay

Die genauen Proteingehaltsbestimmungen verschiedener EibG-haltiger Lysate erfolgten nach der Methode von Markwell et al. (1978). Hierbei handelt es sich um eine modifizierte Methode nach Lowry et al. (1951), mittels einer Kombination der Biuret-Reaktion mit dem Folin-Ciocalteu-Phenol – Reagenz. Im wässrigen, alkalischen Milieu komplexieren Peptidbindungen Cu²⁺. Dabei entsteht ein rot-violett – gefärbter Kupfer-Protein-Komplex, der wiederum ursächlich für die Reduktion von Cu²⁺

zu Cu⁺-Ionen in Verbindung mit dem Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagenz ist. Die tief blaue Färbung kann bei 630 nm gemessen werden. Die Bestandteile der verwendeten Lösungen sind in

Tabelle 7 aufgelistet. Da je nach Versuchsansatz sehr viele Proben auf deren Proteingehalt gleichzeitig untersucht wurden, wurden die Experimente in Mikrotiterplatten mit anschließender Messung im ELISA-Reader durchgeführt. Je 2 bzw. 5 µL der zu untersuchenden Probe wurden mit ddH2O auf 60 µL Gesamtvolumen gebracht. Dieser Lösung wurden dann 200 µL Lösung C hinzugegeben und 15 min bei RT inkubiert. Zu jeder Probe wurden danach 20 µL Lösung D hinzu gegeben und 45 min bei RT weiter inkubiert, wonach die Proben bei 630 nm gegen einen Blindwert (ddH2O) gemessen wurden.

Die notwendigen Kalibrierungsgeraden wurden mittels einer BSA-Verdünnungsreihe erstellt. Dabei wurde BSA (1 mg/mL), ähnlich den zu bestimmenden Proben, in verschiedenen Konzentrationen mit ddH2O verdünnt und parallel zu den Proben vermessen.

Tabelle 7: Lösungen für die Proteinkonzentrationsbestimmung nach Markwell et al. (1978) Lösung Bestandteile

Lösung A 2% (w/v) Na2CO3, 0,17% (w/v) K-Na-Tartrat, 1% SDS (w/v), 10% (v/v) 1 mol/L NaOH Lösung B 4% (w/v) CuSO4

Lösung C Lösung A/Lösung B (99/1)

Lösung D Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagenz/ddH2O (1/1)

Bradford-Assay

Eine wesentlich schnellere und gegenüber verschiedenen Pufferbestandteilen unempfindlichere Proteinkonzentrationsbestimmung stellt der Bradford-Assay dar (Bradford, 1976). Hierbei wird der blaue Säurefarbstoff Coomassie-Brillantblau G 250 verwendet, der im sauren Milieu und in Gegenwart von Proteinen eine Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm nach 595 nm erfährt. Als Bradford-Reagenz wurde das kommerziell erhältliche BioRad Protein Assay Dye Reagent Concentrate – Reagenz eingesetzt. Dafür wurde ein Teil dieses Reagenzes mit vier Teilen Wasser vermischt, und zu je 10 µL der zu untersuchenden Probe wurden 200 µL des verdünnten Konzentrats gegeben. Nach 10 min Inkubation wurden die Ansätze mit dem ELISA-Reader bei 595 nm vermessen.

3.6.4 Gelelektrophoretische Auftrennung EibG-positiver E. coli – Lysate

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

Die SDS-PAGE ist eine Standardmethode zur Trennung von Proteingemischen in einzelne Proteinfraktionen. Das negativ geladene SDS überdeckt die Eigenladungen von Proteinen so, dass sich pro Gramm Protein 1,4 Gramm SDS anlagern und somit eine konstante Ladungsverteilung erfolgt. Durch die Zugabe des 4x Lämmli-Puffers (200 mmol/L Tris-HCl, pH 6,8, 5% (v/v) 2-Mercaptoethanol, 8% (w/v) SDS, 0,4% (w/v) Bromphenolblau, 40% (w/v) Glycerin; Laemmli, 1970) wurden SDS und 2-Mercaptoethanol im Überschuss zu den Proteinen hinzugegeben. Durch Erhitzung der Lösung auf 100 °C werden die Sekundär- und die Tertiär-Strukturen von Proteinen durch Aufbrechung der Wasserstoffbrücken und Disulfidbrücken zerstört. Im elektrischen Feld wirkt das Polyacrylamid-Gel (PA-Gel) als eine Art Sieb, und nach entsprechender Zeitvorgabe, die von der angelegten Spannung und der Dichte des Gels abhängt, werden Proteine unterschiedlicher Größen getrennt. Die PA-Gele entstehen durch Quervernetzung von Acrylamid und dem Vernetzer N,N’-Methylenbisacrylamid (Bis), die in einem Verhältnis von 37,5/1 eingesetzt wurden. Die Vernetzungsreaktion wird durch freie Radikale gestartet, die bei den Wechselwirkungen von Ammoniumpersulfat (APS) und dem tertiären aliphatischen Amin, Tetramethylethylendiamin (TEMED), entstehen. Die Größe der Hohlräume zwischen den Polymerketten ist von der Konzentration der einzelnen Bestandteile (Acrylamid, Bis) abhängig.

Bei dem diskontinuierlichen Trennsystem nach Lämmli wird ein großporiges Sammelgel mit einem engporigen Trenngel überschichtet, wobei sich die pH-Werte der Gelpuffer unterscheiden (Tabelle 8).

Beim Anlegen der elektrischen Spannung an das Gel setzen sich die Cl^--Ionen mit hoher Geschwindigkeit in Bewegung. Aufgrund des pH-Wertes von 6,8 liegen die Glycin-Moleküle, die mit dem Elektrodenpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% (w/v) SDS) in das Gel einwandern, mit einer Nettoladung von ca. Null vor und bleiben hinter den Chlorid-Ionen zurück. Zwischen den beiden

Ionen-Feldern entwickelt sich eine Zone geringer Ionendichte, was einen steilen Feldstärke-Gradienten zur Folge hat. In dieser Zone konzentrieren sich die mit SDS beladenen Proteine und wandern als schmale Bande in das Trenngel ein. Der Anstieg des pH-Wertes im Trenngel auf 8,8 bewirkt eine negative Ladung von Glycin-Molekülen, so dass diese die Proteine überholen und schließlich aus dem Gel vor den Proteinen herauswandern. Die Proteinmischung wird im Trenngel aufgrund des „Molekularsiebeffekts“ in Fraktionen gleicher Molekulargewichte aufgetrennt, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit umgekehrt proportional zu dem Molekulargewicht des Proteins ist.

Eine Massenzuordnung wird durch die gleichzeitige Verwendung von Molekulargewichtsmarkern erleichtert. Nach der Trennung erfolgt die Anfärbung der Gele (vgl. Kapitel 3.6.5.).

Tabelle 8: Bestandteile der SDS-PAGE – Gele nach Lämmli für zwei Minigele 10% Trenngel 6% Sammelgel

Bestandteile in mL Trenngelpuffer (0,75 mol/L Tris-HCl, pH 8,8) 7,00 - Sammelgelpuffer (0,25 mol/L Tris-HCl, pH 6,8) - 3,50

10% (w/v) SDS 0,28 0,14

ddH2O 2,00 1,93

Acrylamidlösung: 30% (w/w) Acrylamid,

0,8% (w/w) Bis 4,68 1,40

10% (w/v) Ammoniumpersulfat 0,07 0,04

TEMED 0,02 0,01

Gesamt 14,04 7,02

Die zu untersuchenden Proteinproben wurden im Verhältnis 4:1 mit dem Lämmli-Puffer verdünnt und bei 100 °C 10 Minuten lang aufgekocht. Nach kurzer Zentrifugation in der Tischzentrifuge wurden die Proben in die Geltaschen pipettiert. Die Gelelektrophorese erfolgte für ca. 30 min bei 90 V; nach dem Einwandern der Proben in das Trenngel wurde die Spannung auf 110 V gesetzt.

Nachdem die Bromphenolblaubande aus dem Gel herausgewandert war und die zu untersuchenden Proteine die gewünschte Laufhöhe erreichten, wurde die Gelelektrophorese gestoppt.

Proteintransfer auf Trägermembranen (Westernblot)

Die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteine können aus PA-Gelen elektrophoretisch auf Nitrocellulose-Membranen übertragen werden (Towbin et al., 1979). Dabei entsteht auf der Membran das genaue Abbild des Bandenprofils wie im PA-Gel, und die Proteine können durch immunhistochemische Färbemethoden spezifisch nachgewiesen werden. In dieser Arbeit erfolgte der Westernblot nach dem Prinzip des Tank- bzw. Nasszellen-Blottings. Dabei wurden das Gel, die Membran und das Filterpapier als eine Art Sandwich zwischen vertikal angebrachten Elektroden der Blotapparatur, welche auch für die SDS-PAGE verwendet wurde, angeordnet und der ganze Behälter mit dem Blotpuffer (25 mmol/L Tris, 192 mmol/L Glycin, 0,1% (w/v) SDS, 20% (v/v) Methanol) gefüllt.

Die Geometrie dieses Gerätes und der geringe Abstand zwischen den Elektroden begünstigen den Aufbau von starken homogenen elektrischen Feldern bei geringen Stromstärken und verkürzen dadurch die Transferzeit der Proteine auf die Membran.

Vor dem Blotten wurden die Gele, die Nitrocellulose-Membran und das Filterpapier für 15 min im Blotpuffer inkubiert. Die angelegte Stromstärke betrug für 1 h 250 mA und für weitere 2 h 500 mA

mit einem möglichen Anstieg der Spannung bis 100 V für die erste Stunde und bis 200 V für die verbleibende Transferzeit. Methanol verstärkt die hydrophoben Interaktionen zwischen den Proteinen und der Membran, wobei die optimale Konzentration von diesem erst experimentell ermittelt werden musste. Nach dem Transfer wurden die Proteine auf der Membran mittels Immunfärbung identifiziert (vgl. Kapitel 3.6.5).

Dotblot-Assay

Der Dotblot-Test wurde aufgrund des geringen Verbrauchs an Probenmaterial als schnelle Methode zur Analyse EibG-haltiger Lysate ausgewählt. Dabei wurden die Nitrocellulose-Membran und das Filterpapier im Blotpuffer getränkt und dann in die spezielle Dotblot-Apparatur (Denville Scientific Inc.) eingespannt. Diese Apparatur besteht aus einem, einer 96-well Mikrotiterplatte ähnlichem, Oberteil mit 96 Öffnungen, der unter dem Oberteil eingespannten Membran und einem Reservoir darunter, an den mit einer Wasserstrahlpumpe Unterdruck angelegt wird. Durch den Unterdruck unter der Membran werden die durch die Öffnungen zupipettierten Proteinlösungen auf die Membran gezogen, wo die überschüssige Flüssigkeit abgesaugt wird. Von den immobilisierten Proteinen konnten dann mittels Immunfärbung die gesuchten Proteine sichtbar gemacht werden. So wurden EibG-haltige Fraktionen von denen ohne EibG unterschieden. Das Einsatzvolumen betrug je nach Experiment zwischen 10 und 50 µL je Öffnung.