T RIMERISCHE A UTOTRANSPORTER A DHÄSINE

Trimerische Autotransporter Adhäsine (TAA) sind Mitglieder einer Virulenz-vermittelnden Proteinfamilie, die von gramnegativen Bakterien sekretiert werden und durch den Sekretionsweg Vc (Linke et al., 2006) an die Oberflächen der Bakterien gelangen. Alle TAA sind Homotrimere mit einer konservierten C-terminalen AS-Sequenz, die einen 12 Strang β-Barrel ausbildet und somit die Verankerung der Proteine an die äußere Bakterienmembran gewährleistet.

1.4.1 YadA

Das wohl am besten charakterisierte TAA ist YadA (auch P1) aus enteropathogenen Yersinia Bakterien, welches die Adhäsion an Kollagen, Fibronectin sowie Laminin vermittelt und dadurch die Bindung von Yersinia an intestinale Epithelzellen und Granulozyten des Wirtes ermöglicht (Roggenkamp et al., 1996). Durch die Kolonisation von Yersinia ist YadA an verschiedenen Erkrankungen des Menschen, wie der Diarrhö, der Sepsis, der Lymphadenitis (reaktive Lymphknotenschwellung) oder der reaktiven Arthritis beteiligt (Linke et al., 2006). Weiterhin ist YadA auch bei der Autoaggregation von Yersinia beteiligt, was wesentlich zur Kolonisation beiträgt. Die AS-Sequenzen von Yersinia pseudotuberculosis (YadApstb) und Yersinia enterocolitica (YadAent) unterscheiden sich geringfügig am N-terminalen Ende, was jedoch zu wesentlichen Schwankungen in der Adhäsion an die Komponenten der extrazellulären Matrix der Wirtszellen führen kann.

Deletionsmutanten von YadApstb bewirkten den Verlust der Adhäsion an Fibronektin sowie der invasiven Fähigkeiten von Y. pseudotuberculosis, und wiesen somit die üblichen Eigenschaften von YadAent auf. Dies zeigte, dass auch sehr ähnliche Adhäsine durch den Verlust von einigen Aminosäuren sehr stark in ihrer Bindungsfähigkeit eingeschränkt werden können (Heise und Dersch, 2006).

YadA weist die für TAA typischen sechs Domänen in der Tertiärstruktur des Gesamtproteins auf: die N-terminale Signalsequenz, die Kopfdomäne, den Nackenbereich, den Stiel, die Link-Region und die C-terminale Region, welche für die Ausbildung des β-Barrels mit zwei weiteren β-Regionen der YadA-Monomeren verantwortlich ist. Das β-Barrel wird aus insgesamt 12 antiparallel laufenden β-Faltblättern gebildet, wobei jedes der YadA-Monomere vier dieser Faltblätter zur Gesamtstruktur des β-Barrels beiträgt. Das β-Barrel von YadA ist dem β-Barrel von TolC (vgl. auch Kapitel 1.3.7) sehr ähnlich, obwohl bei TolC das gesamte Protein das β-Barrel ausbildet und bei YadA nur einen kleinen Teil des Proteins ausmacht. Die wichtigste Funktion des β-Barrels von YadA ist dabei die Sekretion der Passenger Domäne durch die innere Pore und die daraufhin folgende Verankerung des gesamten Protein-Komplexes in der äußeren Bakterienmembran. Große Homologien zu der β-Region von YadA

wurden auch in den OMP anderer Bakterien gefunden und lieferten somit die ersten Hinweise auf deren trimere Strukturen. Dazu gehören z. B. die UspA1 und UspA2 von Moraxella catarrhalis sowie Hia aus Haemophilus influenzae. An die β-Domäne vom C-terminalen Ende aus folgende Linker-Region ist ebenfalls an der Translokation der vollständigen Passenger Domäne beteiligt. Bei Mutationen in diesem Bereich wird sogar das gesamte Protein abgebaut. Ähnliche Linkerregionen sind unter den Autotransportern weit verbreitet, wobei bisher keine Sequenzhomologien bekannt sind, was an der monomeren Struktur anderer Vertreter der Autotransporter zu liegen scheint. Die folgende Stiel-Region wird aus den drei monomeren Strukturen von YadA als eine sich linksdrehende Spirale aus α-Helizes aufgebaut (coiled coil structure), die dann in der als Nacken (neck) bezeichneten Struktur endet. Zusammen mit der Kopfdomäne bildet die ca. 20 Aminosäuren große Nackenregion den bindungsvermittelnden Teil von YadA. Deletionsmutanten des Nackenbereichs zeigten verringertes Adhäsionsverhalten von YadA, hatten aber keine Auswirkung auf die Serumresistenz, welche von manchen Autotransportern, sowie auch von dem mutationsfreien YadA, vermittelt werden kann. Die wichtigste Domäne für die Bindung an verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix der Wirtszellen ist an dem äußersten Ende von YadA lokalisiert. Die Kopfdomäne zeigt auch zu anderen N-terminalen Enden verschiedener TAA große Homologien, welche die Adhärenzfähigkeiten dieser Proteine ausmachen (Roggenkamp et al., 2003; Henderson et al., 2004). Deletionen der YadA29-81-Bereiche führten zum Adhäsionsverlust an neutrophile Granulozyten des Wirtes, wobei die Bindung zu Kollagen und Laminin immer noch vorhanden war.

Die Kollagenaffinität und die Autoagglutinationsfähigkeit von YadA wurden durch die Deletion von YadA83-104 gänzlich aufgehoben. Durch weitere Versuche mit Deletionsmutanten konnten die AS-Sequenzen für die Kopfdomäne (YadA26-194) und für den Nackenbereich (YadA195-219) exakt ermittelt werden (Nummelin et al., 2004).

YadA-Gene sind auf dem Virulenzplasmid von Yersinia kodiert und weisen in der monomeren exprimierten Form ein ca. 44 kDa großes Protein in SDS-PAGE – Gelen auf. Die trimere Proteinform von YadA ist sehr stabil, und auch 20-minütige Behandlungen bei 80 °C oder mit 1 M Harnstoff konnten die Bindung an Kollagen (Typ I) nicht verringern. Die trimere Form von YadA kann auch nach dem Aufkochen der Proben in den SDS-PAGE – Gelen nachgewiesen werden, was ebenfalls auf die sehr starken Bindungen der einzelnen Monomere zueinander hinweist. Nach Infektion der intestinalen Mukosa durch Yersinia-Bakterien und der Invasion durch die chromosomal kodierten Yersinia-Proteine Invasin und Ail bildet YadA den wichtigsten Adhäsionsfaktor an Epithelzellen (Nummelin et al., 2004).

1.4.2 EibD

Untersuchungen neueren Datums mit weiteren TAA-Vertretern lieferten einen vertieften Einblick in die Struktur von YadA und ähnlichen Proteinen (UspA1, UspA2 und Hia). Das aus der Eib-Familie (Kapitel 1.7) stammende EibD (E. coli immunglobulin binding protein D) konnte 2011 durch Kristallstrukturanalysen verschiedener Bereiche der Passenger Domäne sowohl als TAA bestätigt werden, als auch mehr Informationen zum Aufbau und zur Funktionsweise ähnlicher Proteine liefern.

EibD wird von Intimin-negativen STEC-Stämmen exprimiert und vermittelt erhöhte Adhärenz von E. coli an intestinale Epithelzellen; außerdem bindet es an humanes IgA und IgG und ist an der Serumresistenz der STEC beteiligt (Leo et al., 2011).

Zwei Bereiche von EibD (EibD161-418 und EibD391-440) wurden experimentell genauer untersucht wonach ein Modell von EibD mit einer verlängerten Lutscher ähnlichen – Struktur (elongated

lollipop-like structure) postuliert wurde (Abb. 8). Dieser besteht aus einer linksdrehenden parallelen β-roll Domäne, EibD160-291 (LPBR: left-handed parallel β-roll domain), die der Kopfdomäne von YadA sehr ähnelt, aus dem Nacken-Bereich und aus dem Stielbereich. Der YadA-ähnliche Kopfbereich von EibD setzt sich aus mehreren Wiederholungssequenzen und somit aus β-Faltblättern zusammen, die sowohl hydrophobe intramolekulare, als auch hydrophile Bereiche zwischen den einzelnen drei Monomeren aufweisen. Eine Besonderheit von EibD ist hier ein hervorstehender Bereich zwischen den beiden letzten Sequenzwiederholungen für das β-Blatt. Dieser Bereich gehört zu dem sich anschließenden Baustein von EibD, dem Nacken, welcher den Rest des Polypeptids um 120° im Uhrzeigersinn rotieren lässt. Der Stiel von EibD wird in drei weitere Bereiche unterteilt: den rechtsdrehenden coiled-coil Bereich unter dem Nackenbereich (EibD292-349), den Sattelbereich (EibD345-380) und den linksdrehenden coiled-coil Bereich unterhalb des Sattels (EibD381-417). Der Sattelbereich ist für die weitere Windungsänderung innerhalb der Proteinstruktur verantwortlich, wodurch der linksdrehende Bereich um 120° zu dem vorherigen Verlauf gedreht wird.

Durch die Generierung von Punktmutationen in EibD konnten die Bindungsdomänen für IgA und für IgG identifiziert werden. Die Expression von EibD an der Oberfläche der Bakterien wurde durch Elektronenmikroskopie sowie Autoaggregationstests untersucht, wobei in flüssigen Nährmedien ein ähnlich schnelles Absinken der Bakterien auf die Gefäßböden festgestellt wurde, wie dies auch für andere Bakterien mit Autotransportern, wie z. B. mit Ag43, typisch ist. EM-Aufnahmen zeigten weiterhin die Expression von EibD an der bakteriellen Oberfläche und in den Bereichen des bakteriellen Zell-Zell-Kontakts. Dies lässt die Vermutung zu, dass EibD partiell an der Aggregation der Zellen beteiligt ist. Die Kettenausbildung der EibD-positiven Stämme konnte von Lu et al. allerdings nicht gezeigt werden, wobei die Bakterien eher zur Verklumpung tendieren. Als Erklärung wird das Fehlen physiologischer Bedingungen in ex-vivo Experimenten aufgeführt, welche zur Kettenausbildung beitragen sollen (Lu et al., 2006). In weiteren Experimenten wurde die Formierung von Biofilmen durch EibD-positive Bakterien nachgewiesen.

Abb. 8: EibD mit einzelnen strukturellen Bereichen. Modifiziert nach Leo et al., 2011.

(Kopf und Nacken) EibD160-291; (RHcc) rechtsdrehender coiled-coil Bereich, EibD292-349; (Sattel) EibD345-380; (LHcc) linksdrehender coiled-coil Bereich, EibD381-417; (Membrananker) EibD417-511; (IgA-Bindungsdomäne) EibD329-344; (IgG- Bindungsdomäne) EibD384-418.

Weiterhin konnte beim EibD die Bindung an IgG Fc mit Protein A aus Staphylococcus aureus (SpA) blockiert werden, was auf ähnliche Affinitätsbereiche zu IgG Fc hindeutet. Von Lu et al. wurde leider wenig auf die Signalsequenz von EibD eingegangen, welche ja nur die ersten 20 bis 30 AS ausmachen soll. Der Bereich EibD1-159 blieb somit nur ungenau untersucht. Im Vergleich zu YadA müsste der

AS-Bereich EibD26-260 noch zur Kopf-Domäne gehören und die restlichen Aminosäuren(EibD260-291) müssten zum Nacken gezählt werden. Rein rechnerisch eribt sich daher ein ca. 60-70 Aminosäuren langer Bereich, der noch nicht genau untersucht wurde und dessen Funktionen noch nicht bekannt sind.