Teil 2 – Experimentelle Infektion mit Salmonella Derby
3.2 Versuchstiere und Haltung
Teil 1
Vorbereitung und Auswahl
Der Herkunftsbetrieb der in den Versuchen verwendeten Tiere war ein Ferkelerzeugerbetrieb mit zum Zeitpunkt der Untersuchungen etwa 420 Sauen dänischer Genetik (Dänische Landrasse 50 % x Yorkshire 50 %), die Bewirtschaftung erfolgte im 2-Wochen-Rhythmus. Es fanden im Erzeugerbetrieb regelmäßig Impfungen statt, wobei die Sauen gegen PRRSV, SIV, PPV und Erysipelothrix rhusiopathiae, die Ferkel (DKxPietrain) gegen PCV2, Mykoplasmen und HPS vakziniert wurden. Zudem wurde eine stallspezifische Muttertier-Vakzine eingesetzt, die sich gegen E.coli und Clostridieninfektionen bei Saugferkeln richtete. Im Rahmen regelmäßiger und langjähriger Screeningprogramme zeigte sich der Betrieb zudem unauffällig im Hinblick auf Salmonellen und Brachyspiren. Klinische Erscheinungen einer Lawsonia intracellularis Infektion (bestätigt durch Erregernachweis) waren in diesem Betrieb hingegen ein regelmäßig auftretendes Problem in einem Lebensalter der Ferkel von etwa sieben bis neun Wochen. Für die Versuche wurden vier bis fünf komplette Würfe von insgesamt jeweils etwa 42 Würfen im Alter von 21 Tagen mit Enterisol®Ileitis per os mittels Drench vacciniert.
Diese Ferkel wurden durch eine individuelle Kennzeichnung markiert. Nach dem Absetzen
erfolgte die Aufstallung aller Ferkel je nach Stallabteil in der Ferkelaufzucht in Gruppen von etwa 12 bis etwa 30 Tieren. Hierbei wurden die vakzinierten Ferkel im Herkunftsbetrieb nicht separat in einzelne Abteile bzw. Buchten in den Abteilen aufgestallt, sodass es zu einer Durchmischung von vakzinierten und nicht vakzinierten Tieren (nur im Herkunftsbetrieb bis zum Zeitpunkt des Transportes) kam. Die Gestaltung der Buchten erlaubte zudem einen intensiven Austausch von Se- und Exkreten sowie Staub zwischen benachbarten Gruppen, teilweise haben einzelne Tiere die Buchtenwände aufgrund der geringen Höhe der Abtrennungen überwunden, sodass es auch nach Aufstallung in die Ferkelaufzucht zur fortwährenden Durchmischung der Gruppen kommen konnte.
Die Beprobung erfolgte zunächst einmal die Woche mittels Sammelkotprobe. Sobald diese sich positiv darstellte (PCR) und die nicht vakzinierten Schweine anfingen, dünnbreiigen Kot abzusetzen, fand eine individuelle Kotentnahme aus dem Rektum (alle 2-3 Tage) und eine Untersuchung derselben via PCR statt. Wenn die Infektion soweit um sich gegriffen hatte, dass an einem Untersuchungstag genügend für den jeweiligen Versuchsdurchgang erforderliche Individuen zur Verfügung standen, wurde die Beprobung auf dem Betrieb zunächst eingestellt, bis wieder Tiere für den nächsten Durchgang gefunden werden mussten.
Jeweils drei dieser Schweine (VAC – CF +) wurden zusammen mit drei geimpften Tieren (VAC +) und drei nicht geimpften und klinisch unauffälligen Tieren (VAC – CF -) desselben Durchgangs ins Institut für Tierernährung nach Hannover verbracht, sodass die Versuche möglichst zeitnah zum bestätigten Infektionsbeginn begannen (zwei Tage zw. Beprobung und Abtransport der Tiere an die Universität). Alle Schweine eines Durchgangs entstammten derselben Altersgruppe. Die Auswahl der Tiere aus Gruppe VAC + und Gruppe VAC – CF - orientierte sich am Gewicht der ausgewählten Tiere der Gruppe VAC – CF +, sodass für alle Schweine diesbezüglich gleiche Ausgangsbedingungen herrschten.
Institut für Tierernährung
An insgesamt 27 Mastläufern wurden im zentralen Tierhaus der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Bilanzversuche durchgeführt. Es handelte sich um 13 männliche kastrierte und 14 weibliche Tiere.
Diese wurden als Mastläufer mit etwa sieben bis acht Wochen und einer durchschnittlichen Körpermasse von 19,0 ± 1,50 kg in drei Durchgängen zu je neun Tieren im Tierhaus
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In jedem Versuchsdurchgang wurden drei verschiedene Versuchsgruppen zu je drei Tieren gebildet:
Gruppe 1: gegen Lawsonia intracellularis geimpft (VAC +) Gruppe 2: nicht gegen L. i. geimpft, klinisch gesund (VAC - CF -) Gruppe 3: nicht gegen L. i. geimpft, klinisch auffällig (VAC – CF +)
Die Läuferschweine wurden von Versuchsbeginn an einzeln in 3 x 1 m großen Buchten untergebracht. Diese waren ausgestattet mit einer Nippeltränke, einem 1 m langen Steinguttrog an der Mittelgangseite, einer Infrarot-Wärmelampe und einer Spielkette. Die seitliche Abgrenzung erfolgte über Metallgitter, sodass jederzeit Sichtkontakt gegeben war.
Zwischen den Einzelbuchten befand sich jeweils eine leere Bucht, damit kein direkter Kontakt zu den Nachbartieren ermöglicht wurde. Die Haltung erfolgte einstreulos auf planbefestigtem Boden, im hinteren Teil der Bucht befanden sich ca. 20 cm breite Lochbleche als Kotrost.
Der Eingangsbereich dieses von anderen Tierhaltungen abgegrenzten Bereiches war mit einer Desinfektionsmatte ausgestattet, auch standen für jede Gruppe, also jeweils drei Tiere, separate Schutzkleidung sowie separate Gerätschaften zur Verfügung.
Alle drei Durchgänge wurden identisch gehalten. Um mögliche Einflüsse der Umgebung auf die erhobenen Daten zu vermeiden, rotierte die Belegung der Buchten mit den entsprechenden Gruppen im Uhrzeigersinn.
Abbildung 1: Aufstallung der Ferkel im ersten Versuchsteil Eingang
leer Bucht A1 leer Bucht A2 leer Bucht A3 leer Bucht B1 leer Bucht B2
leer leer Bucht C3 leer Bucht C2 leer Bucht C1 leer Bucht B3 leer
Teil 2
Vorbereitung und Auswahl
Die Auswahl der Schweine erfolgte auf demselben Betrieb und im Ablauf identisch zum ersten Versuchsteil (siehe 3.2. Teil 1), einzig mit dem Unterschied, dass zusätzlich zu den direkt aus dem Rektum entnommenen Kotproben auch zeitgleich Blutproben entnommen und auf Antikörper gegen L. i. und Salmonellen untersucht wurden. Von den L. i. positiven Schweinen wurden pro Durchgang zwölf im Gewicht möglichst identische Tiere ausgewählt und zeitnah zur Untersuchung aus dem Betrieb entnommen und in das Institut für Tierernährung verbracht. Zeitgleich erfolgte die Auswahl von zwölf geimpften Schweinen der gleichen Altersgruppe. Auch diese wiesen ein möglichst homogenes Gewicht untereinander und im Vergleich zur Lawsonien-positiven Gruppe auf, sodass beide Versuchsgruppen hinsichtlich Alter und Gewicht gleiche Voraussetzungen hatten.
Institut für Tierernährung
An insgesamt 72 Mastläufern wurden im zentralen Tierhaus der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Infektionsversuche durchgeführt (Tierversuchsantrag 33-9-42502-04-12/0902). Es handelte sich um 42 männliche kastrierte und 30 weibliche Tiere. Auch hier wurde bei der Einteilung der Tiere auf möglichst einheitliche Ausgangsbedingungen bezüglich Geschlecht und Gewicht in jeder Gruppe geachtet. Das Geschlechterverhältnis ließ sich allerdings aufgrund der begrenzten Auswahlmöglichkeiten nicht völlig homogen gestalten, so dass in Gruppe 1 in drei Durchgängen 18 männliche kastrierte Schweine und 18 weibliche aufgestallt wurden, in den drei Durchgängen von Gruppe 2 (L .i. positiv) hingegen 24 männliche kastrierte und nur zwölf weibliche Tiere eingestallt wurden. Diese wurden mit etwa sieben Wochen und einer durchschnittlichen Körpermasse von 23,2 ± 2,11 kg in drei Durchgängen zu je 24 Tieren im Infektionsstall des Tierhauses eingestallt (siehe Tabelle 33).
In jedem Versuchsdurchgang wurden zwei verschiedene Versuchsgruppen zu je zwölf Tieren gebildet:
Gruppe 1: gegen L. i. geimpft (VAC +)
Gruppe 2: nicht gegen L. i. geimpft, L. i. positiv und therapeutisch mit Tylosin behandelt (VAC -)
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Die Unterbringung der Schweine erfolgte in zwei Gruppen zu je zwölf Tieren. Diese wurden in zwei miteinander verbundenen Buchten mit einer Gesamtgröße von ca. 6 m² eingestallt.
Die Versuchsgruppen wurden schräg gegenüberliegend aufgestallt und die Buchtenbelegung wechselte nach jedem Durchgang.
Für jede Gruppe standen separate Schutzkleidung und Gerätschaften zur Verfügung, vor jeder Bucht zudem eine Desinfektionswanne, um eine Verschleppung des Testkeims über das Schuhwerk zu verhindern. Ausgestattet waren die Buchten mit jeweils zwei 80 cm breiten schwenkbaren Metalltrögen, Nippeltränken, planbefestigtem Boden und einem ca. 0,2 m breiten Kotrost im hinteren Bereich der Bucht. Auf die zunächst installierten Infrarot-Wärmelampen wurde im Verlauf der Sommermonate verzichtet. Jeweils zwei Tiere pro Gruppe wurden am Tag der experimentellen Infektion mit Salmonellen vom Rest der Gruppe getrennt, indem sie zusammen in eine benachbarte Bucht von ca. 3 m² umgesetzt wurden. Erst nach der diagnostischen Bestätigung der erfolgreichen Infektion (Kontrolle per Rektaltupfer in Verbindung mit einer kulturellen Anzucht) wurden die Tiere zwei Tage später zurück in ihre Gruppen gesetzt. Dieses Infektionsmodell wurde gewählt, um die praxisüblichen Bedingungen zu simulieren (mögliche Ansteckung durch Kontaktinfektion; PAPENBROCK 2005).
Abbildung 2: Aufstallung der Versuchstiere im zweiten Versuchsteil in einem S2-Infektionsstall
Eingang Schleuse
Bucht A1
Bucht B1 Bucht A
Bucht B Rotation bei jedem Durchgang
3.3 Versuchsablauf
Teil 1
Der Versuchsablauf war für alle drei Durchgänge identisch.
Die nachfolgende Abbildung gibt den Versuchsablauf schematisch wieder.
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Versuchsablaufes Teil 1 vom Einstallen über die Adaptationsphase und Bilanz bis zur Sektion; identisches Versuchsfutter ad lib.
für alle Tiere während der gesamten Aufstallung
Teil 2
Der Versuchsablauf war für alle drei Durchgänge identisch.
Die nachfolgende Abbildung gibt den Versuchsablauf schematisch wieder.
3 Tage
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Abbildung 4: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs für den Teil 2 (Behandlung, experimentelle Infektion, Verlaufsuntersuchung, Sektion) der Gruppe VAC + im Vergleich zur Gruppe VAC -.
3.4 Futter
3.4.1 Futtermittel und Fütterung Teil 1
Die Schweine erhielten während des gesamten Versuches weiterhin Futter ihres Herkunftsbetriebes, ein schrotförmiges Mischfutter aus hofeigener Herstellung, an welches sie dementsprechend bereits adaptiert waren. Alle Schweine erhielten also ein identisches Alleinfuttermittel. In allen drei Durchgängen kam nur eine Produktionscharge zum Einsatz.
Die botanische Zusammensetzung des Mischfutters ist in Tabelle 3 dargestellt.
VAC +
Behandlungsbeginn (10 mg/kg KGW) 10 38
„seeder“
Tabelle 3: Mischfutter-Zusammensetzung nach Komponenten, Versuchsteil 1
Komponente Anteile in der Ration (%)
Weizen 41
Gerste 35
Sojaextraktionsschrot 18
Sojaöl 2
Movikalin speed 10, Mineralfutter für Ferkel
ab 10 kg 4
Zwecks Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit wurde dem Mischfutter bereits in der Adaptationsphase Chromoxid (CrO) als unresorbierbarer Marker (0,5 %ig) beigegeben.
Dieses wurde zur besseren Mischbarkeit mit etwas Wasser und Futter zu einem Brei bereitet und den Tieren jeden Morgen um sieben Uhr in den Trog gegeben. Die Menge des Futters wurde ausreichend bemessen, so dass eine ad libitum Aufnahme stets gewährleistet war. Die Rückwaage der verbliebenen Futterreste des Vortages erfolgte nach Trocknung bis zur Gewichtskonstanz im Trockenschrank bei 103 °C.
Am Tag der Sektion wurden die Schweine zeitlich derart getaktet gefüttert, dass eine bei jedem Tier gleichbleibende Zeitspanne von acht Stunden zwischen Fütterung und Todeszeitpunkt vorlag.
Teil 2
Die Absetzferkel aus dem zweiten Versuchsteil erhielten ab Einstallung bis Versuchsende ein eigens für sie hergestelltes schrotförmiges Mischfutter der For Farmers-Bela GmbH, 49377 Langförden. Bei diesem handelte es sich um ein Alleinfuttermittel für Mastschweine, einsetzbar bis zu einer Körpermasse von ca. 60 kg, ohne Zusatz organischer Säuren und mit sehr geringem Kupfer- und Zinkgehalt (Deklaration: Kupfer: 15 mg/kg; Zink: 150 mg/kg).
Alle Tiere erhielten ein identisches Futter. Für jeden Durchgang wurde eine neue Charge Versuchsfutter in gleichbleibender Zusammensetzung angemischt. Die Tabelle 4 gibt einen Überblick über die Zusammensetzung des eigens für den Versuch angemischten Mischfutters.
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Tabelle 4: Zusammensetzung des im zweiten Teil in Kontroll- und Versuchsgruppe verwendeten Alleinfutters
Die Tiere wurden gruppenweise und ad libitum gefüttert, sodass der tatsächliche Futterverbrauch nur pro Gruppe und nicht pro Individuum zu ermitteln war. Die Fütterung erfolgte einmal täglich (8:00 Uhr). Vorab wurde die nicht aufgenommene Menge des Futters vom Vortag quantifiziert. Diese Vorgehensweise wurde auch in der Zeit, in der die zu infizierenden Tiere einzeln aufgestallt waren, beibehalten. Diese erhielten am Tag der Infektion um 6:30 Uhr jeweils 50 g Futter, um einer Keimreduktion bei der Magenpassage, verursacht durch ein zu saures Magen-Milieu, vorzubeugen. Nach Aufnahme dieses Futters wurden diese Schweine eine Stunde später mit weiteren 50 g des Futters, denen die Infektionsbouillon mit einer definierten Erregermenge zugesetzt war, gefüttert und nach deren vollständiger Aufnahme wie gewohnt ad libitum versorgt.
3.4.2 Futtermitteluntersuchungen Teil 1
Mittels Probenstecher wurde jeweils eine repräsentative Stichprobe des in den drei Durchgängen verwendeten Mischfutters entnommen, um sie chemisch und strukturell zu analysieren. Für die chemische Analyse war das vorherige Mahlen der Probe notwendig (Zentrifugenmühle ZM 1000, Fa. Retsch, Haan; 10.000 Umdrehungen pro Minute, 0,5mm-Sieb).
Teil 2
Eine repräsentative Probe jeder Charge wurde mittels Probenstecher entnommen und chemisch untersucht. Es erfolgte eine Bestimmung der Rohnährstoffe sowie der Mengen- und
Spurenelemente identisch zu Teil 1 (vgl 3.4.2.1 und 3.4.2.2).
3.4.2.1 Bestimmung der Rohnährstoffe
Die Bestimmung der Rohnährstoffe erfolgte mittels Weender Analyse, gemäß den amtlichen Methoden für die chemische Untersuchung von Futtermitteln der VDLUFA (Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten), Methodenbuch III (NAUMANN U. BASSLER 1976) einschließlich der achten Ergänzung von 2012 sowie institutsinternen Modifikationen.
Die Analysen wurden stets im Doppelansatz durchgeführt.
Trockensubstanzgehalt (TS-Gehalt)
3 g Probenmaterial wurden zwecks Bestimmung der TS in einen gewichtskonstanten Porzellantiegel eingewogen und über Nacht bei 103 °C im Trockenschrank bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Nach Abkühlung im Exsikkator wurden die Proben ausgewogen und der TS-Gehalt in g/kg der ursprünglichen Substanz (uS) ermittelt.
Rohasche (Ra)
Die Rohasche setzt sich aus den anorganischen Substanzen zusammen (Mengen-, Spurenelemente und HCL-unlösliche Asche).
Etwa 3 g Probenmaterial wurden hierzu im Muffelofen bei 600 °C über 6 Stunden verascht und nach Abkühlung im Exsikkator zurückgewogen. Der Anteil an Rohasche in den Proben entspricht dem Quotienten aus Auswaage und Einwaage.
Rohprotein (Rp)
Der Gesamtstickstoffgehalt wurde mittels des Analysators Vario Max ® (Fa. Elementar, Hanau) bestimmt, welcher nach dem Prinzip einer katalytischen Rohrverbrennung (DUMAS-Verbrennungsmethode) arbeitet. Hierzu wurden 0,3 g Probenmaterial in einen Keramiktiegel eingewogen und unter Sauerstoffzufuhr bei über 1000 °C im Analysator verbrannt. Der durch Reduktion aus Stickoxid gebildete molekulare Stickstoff wurde mit Hilfe eines Wärmeleitfähigkeitdetektors erfasst und der Stickstoffgehalt durch die geräteeigene Software berechnet. Durch Multiplikation mit dem Faktor 6,25 ergab sich daraus der Rohproteingehalt der Probe.
68 Rohfett (Rfe)
Zur Bestimmung des Rohfettgehaltes der Probe wurden 3 g Probenmaterial 30 Minuten unter Aufkochen mit 100 ml Wasser und 60 ml einer 30%igen Salzsäure aufgeschlossen.
Anschließend wurde mit 300 ml Wasser aufgefüllt. Mittels eines Faltenfilters (595 1/2 D 185 mm, Fa. Schleicher & Schuell Micro Science GmbH, Dassel) wurde die Probe filtriert und der Filter mit Rückstand bei 80 °C im Trockenschrank getrocknet. Die Extraktion des Fettes erfolgte mit 100 ml Petrolether im Soxhletapparat über einen Zeitraum von sechs Stunden.
Mittels Rotationsverdampfer (Rotavapor R114, Fa. Büchi, Schweiz) wurde der zugesetzte Petrolether abdestilliert. Anschließend erfolgte die Trocknung der Kolben bei 80 °C im Trockenschrank. Der Rfe-Gehalt konnte abschließend durch Wägung ermittelt werden.
Rohfaser (Rfa)
Die Rohfaser ist der nach dem Waschen in verdünnten Säuren und Laugen unlösliche, fett- und aschelösliche Rückstand.
1 g Probematerial wurde in eine Glasfritte eingewogen und im Rohfaser-Extraktor (Fibertec 2010 Hot Extractor, Fa. Foss, Schweden) nacheinander mit 100 ml einer 1,25%igen Schwefelsäure und 100 ml einer 1,25%igen Natronlauge aufgekocht. Der Rückstand wurde gewaschen, bei 103 °C im Trockenschrank getrocknet und abschließend gewogen. Zur Bestimmung des Ra-Anteils wurde die Probe bei 500 °C verascht und nach Abkühlung erneut gewogen. Die Differenz der Massen vor und nach der Veraschung gibt den Rfa-Gehalt wieder.