Versuchsschemata

3.5.1 Effekt der mukosalen Kaliumkonzentration auf den transepithelialen Strom

Isolierte Epithelien von Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon von Ziegen und Schafen und Pansenepithel von Rindern wurde serosal mit Standardpufferlösung inkubiert. Die Standardpufferlösung enthielt Natrium. Mukosal wurde mit natriumfreier Pufferlösung inkubiert. Zunächst wurden die Kurzschlussströme bei einer mukosalen Kaliumkonzentration von 4 und 100 mmol∙l^-1 gemessen. Für eine mögliche Korrelation von Kaliumkonzentration und Strom wurden zusätzlich an Ziegenepithel Kurzschlussströme bei mukosalen Kaliumkonzentrationen von 4, 25, 50 und 100 mmol∙l^-1 untersucht.

3.5.2 Effekt von Natrium auf den Kaliumstrom

Hierfür wurden Epithelien von Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon von Ziegen und Pansenepithel von Rindern mukosal mit natriumhaltiger und natriumfreier Pufferlösung inkubiert. Die Kaliumkonzentration betrug 4 oder 50 mmol·l^-1. Serosal wurde mit Standardpufferlösung inkubiert.

3.5.3 Kaliumresorption

Die Kaliumresorption wurde mit Epithelien von Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon vom Schaf untersucht. Mukosal wurde mit natriumfreier Pufferlösung und Kaliumkonzentrationen von 4 und 100 mmol l^-1 inkubiert. Serosal wurde mit Standardpufferlösung inkubiert.

3.5.4 Vergleich von Kalium- und Rubidiumströmen

Nachdem im Pansen und Colon vergleichbare Effekte der mukosalen Kaliumkonzentration auf Kurzschlussstrom und Kaliumresorption beobachtet werden konnten (siehe Kapitel 4.4.3), sollte die Eignung von Rubidium als Marker für den Kaliumtransport im Gastrointestinaltrakt von Wiederkäuern untersucht werden.

Kalium- und Rubidiumströme wurden an Epithelien aus dem Rinder- und Schafpansen, sowie an Colonepithel vom Schaf untersucht. Die mukosale, natriumfreie Pufferlösung enthielt entweder Kalium oder Rubidium, jeweils mit Konzentrationen von 4 und 100 mmol l^-1. Serosal wurde mit Standardpufferlösung inkubiert. Die Kurzschlussströme in kalium- und rubidiumhaltigen Pufferlösungen wurden jeweils am gleichen Epithel gemessen und miteinander verglichen.

3.5.5 Kaliumtransportwege

Um zwischen parazellulären und transzellulären Transportwegen zu unterscheiden, wurde 2,4,6-Triaminopyrimidin als potentieller Blocker des parazellulären Transportweges (BALABAN et al.1979; BOWMAN et al. 1978) mit einer Konzentration von 10 mmol·l^–1, gelöst in 2μl Dimethyl-Sulfoxid, mukosal und serosal hinzugegeben. In Parallelansätzen konnte gezeigt werden, dass Dimethyl-Sulfoxid allein keinen Effekt auf den Kurzschlussstrom hatte. Zur Blockade möglicher Kaliumkanäle wurde Bariumchlorid als potentieller Blocker der meisten Kaliumkanäle (LATORRE u. MILLER, 1983; VAN DRIESSCHE u. ZEISKE 1985) in einer Konzentration von 3 mmol·l^-1 und Verapamil als potentieller Kaliumkanalblocker im Pansen (LEONHARD-MAREK u. MARTENS 1996) in einer Konzentration von 100 µmol·l^-1 hinzugegeben. Die Epithelien stammten vom Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon von Schafen, sowie vom Rinderpansen. Die mukosale Pufferlösung war natriumfrei, bei einer Kaliumkonzentration von 100 mmol·l^-1. Serosal wurde die Standardpufferlösung verwendet.

3.5.6 Effekt der serosalen Kaliumkonzentration auf den transepithelialen Strom

Epithelien von Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon der Ziege wurden serosal mit Standardpufferlösung und mukosal mit natriumfreier Pufferlösung inkubiert. Die mukosale Kaliumkonzentration betrug 100 mmol∙l^-1. Die serosale Kaliumkonzentration betrug 4 oder 2 mmol∙l^-1, um eine hypokaliämische Situation zu simulieren.

3.5.7 Effekt von Stress auf den Kaliumstrom

Da der Pansen grundsätzlich in der Lage ist, Kalium aufzunehmen und so in der Lage sein sollte, Minderaufnahmen im Darm aufgrund von Passagestörungen (zum

Beispiel bedingt durch eine Labmagenverlagerung) auszugleichen, sollte untersucht werden, inwieweit Stress die Kaliumresorption im Pansen beeinflusst. Die folgenden Untersuchungen wurden deshalb ausschließlich mit Pansenepithel durchgeführt.

Serosal wurde mit Standardpufferlösung inkubiert, die mukosale Pufferlösung war natriumfrei.

3.5.7.1 Effekt von Forskolin auf den Kaliumstrom

Epithelien vom Schaf wurden mukosal mit Pufferlösung einer Kaliumkonzentration von 4 oder 100 mmol·l^-1 inkubiert. Epithelien vom Rind wurden zusätzlich mit 50 mmol·l^-1-Kalium-haltiger Pufferlösung inkubiert, um auszuschließen, dass ein Stromanstieg nach Forskolingabe nicht mehr sichtbar ist, da der maximal mögliche transepitheliale Strom in Anwesenheit von 100 mmol·l^-1 Kalium mukosal eventuell bereits erreicht ist. Bei jeder mukosalen Kaliumkonzentration wurde ein potentieller Forskolineffekt durch die mukosale und serosale Zugabe von 10 µmol∙l^-1 Forskolin untersucht. Als Stimulator der Adenylatcyclase (SEAMON et al. 1981) erhöht Forskolin das intrazelluläre cAMP-Level. Durch Bindung von cAMP an die Proteinkinase A wird diese aktiviert. In der Folge kann Proteinkinase A auf die Aktivität von Transportproteinen wirken. Um den Feedback-Kontrollmechanismus der Proteinkinase A auszuschalten, wurde parallel zur Forskolingabe 10 µmol∙l^-1 Isobutyl-Methyl-Xanthin hinzugegeben. Durch die Proteinkinase A wird eine Phosphodiesterase aktiviert, die aktivierte Phosphodiesterase hydrolysiert cAMP zu AMP (BLUM 2005). Isobutyl-Methyl-Xanthin blockiert die Phosphodiesterase (PARSONS et al. 1988). Außerdem enthielten alle Pufferlösungen 1 µmol∙l^-1 Indomethacin, um die endogene Prostaglandin-Produktion zu hemmen, welche das intrazelluläre cAMP-Niveau ebenfalls beeinflussen würde (CRAVEN u.

DERUBERTIS 1983).

3.5.7.2 Effekt von Kalzium und Magnesium auf den Kaliumstrom

Um eine mögliche Beteiligung des unspezifischen Kationenkanals am Forskolineffekt (LEONHARD-MAREK et al. 2005; SIEMER u. GÖGELEIN 1993) zu untersuchen, wurden Schafepithelien mukosal mit magnesiumfreier und magnesium- und kalziumfreier Pufferlösung inkubiert. Der Versuchsansatz fand parallel statt. Forskolin wurde mukosal und serosal zugegeben, die mukosale Kaliumkonzentration betrug hierbei 100 mmol∙l^-1. Anschließend wurde mukosal 2 mmol∙l^-1 Kalzium hinzugegeben, um die Reversibilität zu überprüfen.

3.5.7.3 Effekt von Verapamil auf den Forskolineffekt

Verapamil als potentieller Kaliumkanalblocker im Pansen wurde mukosal in einer Konzentration von 100 µmol·l^-1 vor und nach Forskolingabe hinzugegeben. Hierfür wurden Epithelien vom Schaf verwendet. Die mukosale Kaliumkonzentration betrug 100 mmol∙l^-1.

3.5.7.4 Effekt von Adrenalin und Isoproterenol auf den Kaliumstrom

Epithelien von Schaf und Rind wurden mukosal mit Pufferlösung einer Kaliumkonzentration von 50 mmol·l^-1 inkubiert. Adrenalin und Isoproterenol wurden serosal zugegeben. Adrenalin wurde in 1-, 10- und 100 µmol∙l^-1-Schritten zugegeben, oder direkt mit der höchsten Konzentration von 100 µmol∙l^-1. Isoproterenol wurde in Konzentrationen von 1 oder 100 µmol∙l^-1 zugegeben.

3.5.7.5 Zeiteffekte

Um auszuschließen, dass sich Effekte zeigen, die sich durch die Versuchsdauer oder eine Epithelschädigung nach Pufferlösungswechsel bedingen, wurde die Reihenfolge der Kaliumkonzentrationen beziehungsweise Zugaben gewechselt. Außerdem wurden gleiche Pufferlösungen wiederholt gewechselt, um eventuelle Effekte durch den Puffertausch selbst auszuschließen.