Ziel dieser Arbeit war es die Fähigkeit zur Kaliumresorption der Epithelien in den verschiedenen Abschnitten des Verdauungstraktes der Wiederkäuer zu untersuchen, sowie eine mögliche Beeinflussung derselben durch eine Hypokaliämie oder Stress.
Dazu ergaben sich folgende Fragen:
In welchen Abschnitten des Gastrointestinaltraktes wird beim Wiederkäuer Kalium aufgenommen?
Welches sind die zugrundeliegenden Resorptionsmechanismen?
Beeinflusst ein serosaler Kaliummangel die Kaliumresorption?
Beeinflusst Stress die Kaliumresorption?
Bisher wurden in vitro-Untersuchungen zum gastrointestinalen Kaliumtransport in Abwesenheit eines elektrochemischen Gradienten durchgeführt. Unter einem
üblichen Fütterungsregime sind die Kaliumkonzentrationen luminal in der Regel aber deutlich höher als serosal. Deshalb wurden die Versuche mit verschiedenen transepithelialen Kaliumgradienten durchgeführt. Hierbei wurden Kurzschlussströme und Kaliumresorptionsraten erhoben. Im zweiten Schritt sollten die Transportmechanismen mit Hilfe von 2,4,6-Triaminopyrimidin als potentiellem Blocker der parazellulären Leitfähigkeit, sowie von Barium und Verapamil als potentielle Kaliumkanalblocker näher untersucht werden. Da eine Hypokaliämie über ihre hemmende Wirkung auf die glatte Muskulatur eine Rolle bei der Entstehung gastrointestinaler Störungen spielen kann, wurde anschließend ein potentieller Einfluss verminderter serosaler Kaliumkonzentrationen auf die Kaliumresorption untersucht. Der Einfluss von Stress auf die Kaliumresorption am Pansenepithel wurde mit Hilfe von Adrenalin, dem ß-Agonisten Isoproterenol und cAMP untersucht.
3 Material und Methoden 3.1 Versuchstiere
Für die Versuche konnte Material von je 20 Ziegen und Schafen verwendet werden, die im Rahmen anderer Studien im Physiologischen Institut der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover geschlachtet wurden. Diese Tiere wurden per Bolzenschuss betäubt und anschließend durch Blutentzug getötet. Zusätzlich wurde Gewebe von Rindern und Schafen im Schlachthof Hannover gewonnen. Die Betäubung der Schafe erfolgte elektrisch, die der Rinder per Bolzenschuss. Beide Tierarten wurden direkt im Anschluss durch Blutentzug getötet.
3.2 Probenentnahme
Die Probenentnahme erfolgte bei den Schafen und Ziegen ca. 10 Minuten und bei den Rindern ca. 20 - 25 Minuten nach der Tötung durch Blutentzug. Diese zeitlichen Unterschiede ergaben sich aus den Abläufen im Schlachthof. Es wurde Gewebe aus dem ventralen Pansensack, der großen Kurvatur des Labmagens, des mittleren Jejunums und der Umschlagstelle des proximalen Colons entnommen. Anschließend wurde das Gewebe mit Standard-Pufferlösung (Kap. 3.6) gereinigt und anschließend in Standard-Pufferlösung inkubiert. Für die Epithelien von Labmagen, Jejunum und Colon wurde in Eiswasser gekühlte Pufferlösung verwendet, für das Pansenepithel wurde die Pufferlösung auf 38°C erwärmt, beide Pufferlösungen waren mit 95 % O2
und 5 % CO2 begast. Für die anschließende Untersuchung in Ussing-Kammern wurde die Mukosa nach Eintreffen im Labor von den darunter liegenden Muskelschichten und der Serosa abgelöst.
3.3 Elektrophysiologische Untersuchungen
Die Messungen wurden mit dem Ussing-Kammer-Verfahren durchgeführt. Bei diesem Verfahren werden direkt nach der Schlachtung entnommene und präparierte Epithelien in eine mit Silikonringen abgedichtete Plexiglaskammer eingespannt.
Dadurch entstehen zwei voneinander getrennte Kompartimente, die der ehemals serosalen und der mukosalen Gewebeseite entsprechen. Die Kammern waren über Agar-Pufferbrücken mit je zwei gewebenahen Kalomelelektroden und zwei gewebefernen Silber/Silberchlorid-Elektrodenpaaren verbunden und an eine computergesteuerte Strom-Spannungsklemmeinrichtung (Epithelial Voltage Clamp Model EC 825, Warner Instrument Corp., Hamden, USA) angeschlossen. Jeweils 10, beziehungsweise 13 ml Pufferlösung wurden über ein Gasliftsystem mit 95 % O2 und 5 % CO2 begast und bei 38°C gehalten. Der pH-Wert der Inkubationspuffer stellte sich nach 20minütiger Begasung auf pH 7,4 ein. Die Osmolarität betrug 300 mosmol∙l-1. Die Expositionsfläche betrug 1 cm2 oder 3.14 cm2. Mit Hilfe der verwendeten Silikonringe konnte eine randständige Gewebezerstörung minimiert werden. Die transepitheliale Potentialdifferenz wurde über die Agar-Pufferbrücken und Kalomelelektroden in Bezug zur mukosalen Pufferlösung gemessen. Zudem wurden über die anderen beiden Elektroden definierte Stromimpulse von 100 µA·cm-² von 500 ms Dauer auf das Epithel gegeben, die eine vorübergehende Änderung der
Potenzialdifferenz bewirkten. Hierüber konnte die Gewebeleitfähigkeit bestimmt werden. Bevor das Epithelgewebe in die Kammern eingespannt wurde, wurden der Flüssigkeitswiderstand und das Eigenpotential der Elektroden bestimmt und entsprechend korrigiert. Der Versuchsaufbau lässt sich für verschiedene Verfahren nutzen. Unter Open-Circuit-Bedingungen werden die sich spontan ausbildende Potenzialdifferenz und die Gewebeleitfähigkeit bestimmt. Im hier verwendeten Short-Circuit-Verfahren wird über die beiden gewebefernen Elektroden ein Strom angelegt, der dem durch elektrogenen Netto-Ionentransport vom Gewebe selbst generierten Strom entspricht. Diesen Strom nennt man Kurzschlussstrom. Die resultierende Potenzialdifferenz ist demzufolge 0 mV, es besteht kein elektrischer Gradient mehr.
Der Kurzschlussstrom wird in Ionenäquivalent als Ladungstransfer pro Zeit und Gewebefläche [μeq·cm-2·h-1] angegeben. Durch den Fluss eines positiven Ionenstroms von der mukosalen zur serosalen Seite erhält der Kurzschlussstrom ein positives Vorzeichen, was einer Kationenresorption und/oder Anionensekretion entspricht. Alle Epithelien wurden mindestens 10 Minuten an die Versuchsbedingungen adaptiert. Während dieser Phase wurden die Messwerte auf ihre Plausibilität geprüft. Epithelien, die mit ungewöhnlich hohen Werten auffielen, wurden als mutmaßlich beschädigt eingestuft und durch frisch präparierte ersetzt.
3.4 Messung der Kaliumresorption
Die Kaliumresorptionsraten wurden mit Hilfe der Atom-Absorptions-Spektroskopie bestimmt. Die Nutzung dieses Verfahrens zur Bestimmung der Kaliumresorptionsraten wurde von INAGAKI et al. (2002) beschrieben. Die Atom-Absorptions-Spektroskopie basiert auf der Schwächung (Absorption) einer Strahlung durch Wechselwirkung mit freien Atomen. Da jedes chemische Element ein charakteristisches Linienspektrum besitzt, können über die Auswertung des Differenzspektrums zu einer Referenzmessung ohne Probe Aussagen über die Menge des in der Probe enthaltenen Kaliums getroffen werden. Die Kaliumkonzentration in den hier vorliegenden Proben wurde mit Hilfe des Atom-Absorptions-Spektrometers Unicam Solaar 969 (Fa. Unicam, Kassel, Germany) bestimmt. Um Proben zu gewinnen, wurden Epithelien in Ussing-Kammern gespannt und mit Pufferlösung einer definierten Kaliumkonzentration inkubiert. Hierfür wurden die größeren Ussing-Kammern mit einer Expositionsfläche von 3.14 cm2 genutzt.
Nach 30 Minuten Inkubation wurde jeweils das komplette mukosale und serosale Volumen der Ussing-Kammern als Proben genommen und durch frischen Puffer ersetzt. Diese Inkubationsperiode wurde noch einmal wiederholt. Anschließend wurde mukosal ein anderer Puffer mit einer anderen Kaliumkonzentration verwendet und auch hier wurden in 2 Inkubationsperioden jeweils die kompletten Volumina als Proben genommen. Um die initiale Kaliumkonzentration zu bestimmen, wurden die nicht-inkubierten Puffer beprobt. Zur Bestimmung der Kaliumkonzentration mittels Atomabsorptionsspektroskopie wurden alle Proben verdünnt. Hierzu wurden 100 ml Cäsiumchlorid-Aluminiumnitrat-Pufferlösung mit 2 ml System-Leerwertlösung vermischt und mit aqua tridest. auf 1000 ml aufgefüllt. Die entnommenen Proben wurden mit dieser Lösung im Verhältnis 1:50 (bei Kaliumkonzentrationen um 4 mmol·l-1), beziehungsweise 1:500 (bei Kaliumkonzentrationen um 100 mmol·l-1) verdünnt.
Die Netto-Kaliumresorption von der mukosalen zur serosalen Seite wurde aus der Differenz zwischen der serosalen Kaliumkonzentration vor Inkubation und der Kaliumkonzentration nach Inkubation berechnet.
Kaliumresorption (µeq∙cm-²∙h-1) = [([K]30 - [K]0) ∙ V] / (A ∙ t)
[K]30 = Kaliumkonzentration nach Inkubation (t = 30 Minuten) in µmol∙ml-1 [K]0 = Kaliumkonzentration vor Inkubation (t = 0 Minuten) in µmol∙ml-1 V = Kammervolumen in ml (13 ml)
A = Expositionsfläche des Gewebes in cm2 (3.14 cm²) t = Zeit in Stunden
Zuerst wurden die mukosalen und serosalen Änderungen der Kaliumkonzentration verglichen, um zu untersuchen, ob ein Anstieg der Kaliumkonzentration auf der einen Seite mit einer Abnahme auf der anderen Seite einhergeht. Um eine mögliche Beeinflussung der Kaliumkonzentration durch Zelldetritus einschätzen zu können, wurden jeweils zwei aufeinander folgende Inkubationsmethoden miteinander verglichen. Der Anstieg der Kaliumresorption aufgrund einer mukosalen Kaliumkonzentrationsänderung von 4 auf 100 mmol l-1 wurde aus der serosalen Kaliumkonzentrationsänderung unter diesen Bedingungen berechnet.
3.5 Versuchsschemata
3.5.1 Effekt der mukosalen Kaliumkonzentration auf den transepithelialen Strom
Isolierte Epithelien von Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon von Ziegen und Schafen und Pansenepithel von Rindern wurde serosal mit Standardpufferlösung inkubiert. Die Standardpufferlösung enthielt Natrium. Mukosal wurde mit natriumfreier Pufferlösung inkubiert. Zunächst wurden die Kurzschlussströme bei einer mukosalen Kaliumkonzentration von 4 und 100 mmol∙l-1 gemessen. Für eine mögliche Korrelation von Kaliumkonzentration und Strom wurden zusätzlich an Ziegenepithel Kurzschlussströme bei mukosalen Kaliumkonzentrationen von 4, 25, 50 und 100 mmol∙l-1 untersucht.
3.5.2 Effekt von Natrium auf den Kaliumstrom
Hierfür wurden Epithelien von Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon von Ziegen und Pansenepithel von Rindern mukosal mit natriumhaltiger und natriumfreier Pufferlösung inkubiert. Die Kaliumkonzentration betrug 4 oder 50 mmol·l-1. Serosal wurde mit Standardpufferlösung inkubiert.
3.5.3 Kaliumresorption
Die Kaliumresorption wurde mit Epithelien von Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon vom Schaf untersucht. Mukosal wurde mit natriumfreier Pufferlösung und Kaliumkonzentrationen von 4 und 100 mmol l-1 inkubiert. Serosal wurde mit Standardpufferlösung inkubiert.
3.5.4 Vergleich von Kalium- und Rubidiumströmen
Nachdem im Pansen und Colon vergleichbare Effekte der mukosalen Kaliumkonzentration auf Kurzschlussstrom und Kaliumresorption beobachtet werden konnten (siehe Kapitel 4.4.3), sollte die Eignung von Rubidium als Marker für den Kaliumtransport im Gastrointestinaltrakt von Wiederkäuern untersucht werden.
Kalium- und Rubidiumströme wurden an Epithelien aus dem Rinder- und Schafpansen, sowie an Colonepithel vom Schaf untersucht. Die mukosale, natriumfreie Pufferlösung enthielt entweder Kalium oder Rubidium, jeweils mit Konzentrationen von 4 und 100 mmol l-1. Serosal wurde mit Standardpufferlösung inkubiert. Die Kurzschlussströme in kalium- und rubidiumhaltigen Pufferlösungen wurden jeweils am gleichen Epithel gemessen und miteinander verglichen.
3.5.5 Kaliumtransportwege
Um zwischen parazellulären und transzellulären Transportwegen zu unterscheiden, wurde 2,4,6-Triaminopyrimidin als potentieller Blocker des parazellulären Transportweges (BALABAN et al.1979; BOWMAN et al. 1978) mit einer Konzentration von 10 mmol·l–1, gelöst in 2μl Dimethyl-Sulfoxid, mukosal und serosal hinzugegeben. In Parallelansätzen konnte gezeigt werden, dass Dimethyl-Sulfoxid allein keinen Effekt auf den Kurzschlussstrom hatte. Zur Blockade möglicher Kaliumkanäle wurde Bariumchlorid als potentieller Blocker der meisten Kaliumkanäle (LATORRE u. MILLER, 1983; VAN DRIESSCHE u. ZEISKE 1985) in einer Konzentration von 3 mmol·l-1 und Verapamil als potentieller Kaliumkanalblocker im Pansen (LEONHARD-MAREK u. MARTENS 1996) in einer Konzentration von 100 µmol·l-1 hinzugegeben. Die Epithelien stammten vom Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon von Schafen, sowie vom Rinderpansen. Die mukosale Pufferlösung war natriumfrei, bei einer Kaliumkonzentration von 100 mmol·l-1. Serosal wurde die Standardpufferlösung verwendet.
3.5.6 Effekt der serosalen Kaliumkonzentration auf den transepithelialen Strom
Epithelien von Pansen, Labmagen, Jejunum und Colon der Ziege wurden serosal mit Standardpufferlösung und mukosal mit natriumfreier Pufferlösung inkubiert. Die mukosale Kaliumkonzentration betrug 100 mmol∙l-1. Die serosale Kaliumkonzentration betrug 4 oder 2 mmol∙l-1, um eine hypokaliämische Situation zu simulieren.
3.5.7 Effekt von Stress auf den Kaliumstrom
Da der Pansen grundsätzlich in der Lage ist, Kalium aufzunehmen und so in der Lage sein sollte, Minderaufnahmen im Darm aufgrund von Passagestörungen (zum
Beispiel bedingt durch eine Labmagenverlagerung) auszugleichen, sollte untersucht werden, inwieweit Stress die Kaliumresorption im Pansen beeinflusst. Die folgenden Untersuchungen wurden deshalb ausschließlich mit Pansenepithel durchgeführt.
Serosal wurde mit Standardpufferlösung inkubiert, die mukosale Pufferlösung war natriumfrei.
3.5.7.1 Effekt von Forskolin auf den Kaliumstrom
Epithelien vom Schaf wurden mukosal mit Pufferlösung einer Kaliumkonzentration von 4 oder 100 mmol·l-1 inkubiert. Epithelien vom Rind wurden zusätzlich mit 50 mmol·l-1-Kalium-haltiger Pufferlösung inkubiert, um auszuschließen, dass ein Stromanstieg nach Forskolingabe nicht mehr sichtbar ist, da der maximal mögliche transepitheliale Strom in Anwesenheit von 100 mmol·l-1 Kalium mukosal eventuell bereits erreicht ist. Bei jeder mukosalen Kaliumkonzentration wurde ein potentieller Forskolineffekt durch die mukosale und serosale Zugabe von 10 µmol∙l-1 Forskolin untersucht. Als Stimulator der Adenylatcyclase (SEAMON et al. 1981) erhöht Forskolin das intrazelluläre cAMP-Level. Durch Bindung von cAMP an die Proteinkinase A wird diese aktiviert. In der Folge kann Proteinkinase A auf die Aktivität von Transportproteinen wirken. Um den Feedback-Kontrollmechanismus der Proteinkinase A auszuschalten, wurde parallel zur Forskolingabe 10 µmol∙l-1 Isobutyl-Methyl-Xanthin hinzugegeben. Durch die Proteinkinase A wird eine Phosphodiesterase aktiviert, die aktivierte Phosphodiesterase hydrolysiert cAMP zu AMP (BLUM 2005). Isobutyl-Methyl-Xanthin blockiert die Phosphodiesterase (PARSONS et al. 1988). Außerdem enthielten alle Pufferlösungen 1 µmol∙l-1 Indomethacin, um die endogene Prostaglandin-Produktion zu hemmen, welche das intrazelluläre cAMP-Niveau ebenfalls beeinflussen würde (CRAVEN u.
DERUBERTIS 1983).
3.5.7.2 Effekt von Kalzium und Magnesium auf den Kaliumstrom
Um eine mögliche Beteiligung des unspezifischen Kationenkanals am Forskolineffekt (LEONHARD-MAREK et al. 2005; SIEMER u. GÖGELEIN 1993) zu untersuchen, wurden Schafepithelien mukosal mit magnesiumfreier und magnesium- und kalziumfreier Pufferlösung inkubiert. Der Versuchsansatz fand parallel statt. Forskolin wurde mukosal und serosal zugegeben, die mukosale Kaliumkonzentration betrug hierbei 100 mmol∙l-1. Anschließend wurde mukosal 2 mmol∙l-1 Kalzium hinzugegeben, um die Reversibilität zu überprüfen.
3.5.7.3 Effekt von Verapamil auf den Forskolineffekt
Verapamil als potentieller Kaliumkanalblocker im Pansen wurde mukosal in einer Konzentration von 100 µmol·l-1 vor und nach Forskolingabe hinzugegeben. Hierfür wurden Epithelien vom Schaf verwendet. Die mukosale Kaliumkonzentration betrug 100 mmol∙l-1.
3.5.7.4 Effekt von Adrenalin und Isoproterenol auf den Kaliumstrom
Epithelien von Schaf und Rind wurden mukosal mit Pufferlösung einer Kaliumkonzentration von 50 mmol·l-1 inkubiert. Adrenalin und Isoproterenol wurden serosal zugegeben. Adrenalin wurde in 1-, 10- und 100 µmol∙l-1-Schritten zugegeben, oder direkt mit der höchsten Konzentration von 100 µmol∙l-1. Isoproterenol wurde in Konzentrationen von 1 oder 100 µmol∙l-1 zugegeben.
3.5.7.5 Zeiteffekte
Um auszuschließen, dass sich Effekte zeigen, die sich durch die Versuchsdauer oder eine Epithelschädigung nach Pufferlösungswechsel bedingen, wurde die Reihenfolge der Kaliumkonzentrationen beziehungsweise Zugaben gewechselt. Außerdem wurden gleiche Pufferlösungen wiederholt gewechselt, um eventuelle Effekte durch den Puffertausch selbst auszuschließen.
3.6 Pufferlösungen
Natriumhaltige Pufferlösungen
Standardpuffer-lösung 50 mmol∙l-1 K mmol∙l-1 mmol∙l-1
NaCl 115,0 69,0
KCl 4,0 50,0
CaCl2 x 2H2O 1,2 1,2
MgCl2 x 6H2O 1,2 1,2
HCl 0,2 0,2
NaH2PO4 x H2O 0,6 0,6 Na2HPO4 x 2 H2O 2,4 2,4
Glucose 10,0 10,0
Mannit 19,8 19,8
NaHCO3 21,0 21,0
natriumfreie Pufferlösungen mit unterschiedlichen Kaliumkonzentrationen 4 mmol∙l-1 K 100 mmol∙l-1 K
mmol∙l-1 mmol∙l-1
KCl 1,0 76,0
CaCl2 x 2H2O 1,2 1,2
MgCl2 x 6H2O 1,2 1,2
HCl 118,2 42,2
NMDG (HCl) 120,4 45,4
KH2PO4 3,0 3,0
Glucose 10,0 10,0
Mannit 19,8 19,8
NMDG (HCO3) 21,0 -
KHCO3 - 21,0
Die Pufferlösungen mit Kaliumkonzentrationen von 25 mmol∙l-1 K, beziehungsweise 50 mmol∙l-1 K wurden gemischt.
780 ml 4 mmol∙l-1 K – haltige Pufferlösung + 220 ml 100 mmol∙l-1 K – haltige Pufferlösung = 1000 ml 25 mmol∙l-1 K – haltige Pufferlösung
und
520 ml 4 mmol∙l-1 K – haltige Pufferlösung + 480 ml 100 mmol∙l-1 K – haltige Pufferlösung = 1000 ml 50 mmol∙l-1 K – haltige Pufferlösung.
Rubidiumpufferlösungen
serosal mucosal
4 mmol∙l-1 Rb 100 mmol∙l-1 Rb mmol∙l-1 mmol∙l-1 mmol∙l-1
NaCl 115,0
RbCl 4,0 4,0 100,0
CaCl2 x 2H2O 1,2 1,2 1,2
MgCl2 x 6H2O 1,2 1,2 1,2
HCl 0,2 116,2 40,2
NMDG - 120,4 21,4
NaH2PO4 3,0 - -
H3PO4 3,0 3,0
Glucose 10,0 10,0 10,0
Mannit 19,8 19,8 19,8
NaHCO3 21,0
NMDG (HCO3) 21,0 21,0
NaOH 2,2 - -
Magnesium- und kalziumfreie Puffer (100 mmol∙l-1 K)
Mg2+-frei Ca2+-frei Mg2+-frei mmol∙l-1 mmol∙l-1
KCl 76,0 76,0
CaCl2 x 2H2O 1,2 0,0
MgCl2 x 6H2O 0,0 0,0
HCl 42,2 42,2
NMDG (HCl) 46,6 47,8
KH2PO4 3,0 3,0
Glucose 10,0 10,0
Mannit 19,8 19,8
KHCO3 21,0 21,0
Die Standardpufferlösung wurde auch für den Transport und die Präparation der Epithelien genutzt. Für die natriumfreien Pufferlösungen wurde N-Methyl-D-Glucamin (NMDG) als Ersatz für Natrium verwendet. NMDG kann im Gastrointestinaltrakt nur sehr begrenzt resorbiert werden (GEIBEL et al. 2001).
Der pH aller Pufferlösungen lag bei 7,4 nach Begasung mit 95 % O2 und 5 % CO2. Die Osmolarität wurde mit Mannitol auf 300 mosmol·l-1 eingestellt.
3.7 Chemikalien
CaCl2, BaCl2, MgCl2, HCl und Cäsiumchlorid-Aluminiumnitratpufferlösung stammten von Merck (Darmstadt, Deutschland). Die System-Leerwertlösung stammte von Eppendorf (Wesseling/Berzdorf). Alle anderen Chemikalien stammten von Sigma (Steinheim, Deutschland).
Forskolin wurde in 2, beziehungsweise 2,6 μl Dimethylsulfoxid gelöst und zu 10, beziehungsweise 13 ml der zur Inkubation verwendeten Pufferlösung hinzugegeben.
Die vorliegenden Dimethylsulfoxid-Konzentrationen zeigten bei parallel laufenden Kontrollversuchen keinerlei Effekte auf den Kurzschlussstrom. Isobutyl-Methyl-Xanthin wurde in Ethanol gelöst. Die Ethanolkonzentration lag unter 0,1 %. Diese niedrigen Konzentrationen haben selbst am Epithel keinen Effekt (LINDSTRÖM et al.
1997). Adrenalin und Isoproterenol wurden in Wasser gelöst. Substanzen, die im laufenden Versuch hinzugegeben wurden, wurden als hochkonzentrierte
Stammlösungen angesetzt, um die vorliegenden Pufferlösungsvolumina möglichst wenig zu verändern.
3.8 Statistische Auswertung
Alle Tests erfolgten mit Hilfe des Statistik-Programms GraphPad Prism 4 (www.graphpad.com). Die statistische Analyse beinhaltete die Bestimmung von arithmetischen Mittelwerten und Standardfehler (SEM). Die N-Zahlen entsprechen der Anzahl der Versuchstiere, die n-Zahlen der Anzahl der Epithelien. Wenn die Anzahl von Versuchstieren der Anzahl der Epithelien entsprach, wurde nur N angegeben. Eine statistische Signifikanz wurde mit Hilfe der Varianzanalyse und des Student’s t-Test, beziehungsweise des Wilcoxon signed rank-Tests überprüft. Einige Daten wurden auf eine lineare Regression hin analysiert. Alle Tests wurden auf einem Signifikanzniveau von p<0,05 durchgeführt.
4 Manuskript I
Pathways of gastrointestinal potassium transport in ruminants
Nina Katrin Kronshage§1 and Sabine Leonhard-Marek1,2
1Department of Physiology, University of Veterinary Medicine Hannover, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hannover, Germany
²University Library, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 2, 30559 Hannover, Germany
Short title: gastrointestinal potassium transport
§Corresponding author
Addresses:
NKK: ninakronshage@gmail.com, Department of Physiology, University of Veterinary Medicine Hannover, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hannover, Germany
SLM: sabine.leonhard-marek@tiho-hannover.de Department of Physiology and University Library, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 2, 30559 Hannover, Germany
4.1 Abstract
In ruminants, preintestinal regions can absorb potassium (K), while the small intestine is assumed to be the main site of gastrointestinal K absorption. We investigated the possible contribution of epithelia of the rumen, abomasum, jejunum and colon from goat, sheep and cattle to K absorption, using the Ussing chamber technique. Increasing the luminal K concentration resulted in an increase of current (Δ Isc) across the rumen and colon, but not across the abomasum. In jejunum, the Δ Isc increased in goats. Rubidium as a potential tracer for K showed currents of one third or half of the K currents. In cattle rumen a direct comparison did not show any correlation. Increasing K concentration increased K absorption across the different gastrointestinal segments in the same order of magnitude. However, this increase was significantly higher in jejunum than in rumen and colon. In rumen and colon, the increase in K absorption was equivalent to the parallel Δ Isc. In abomasum and jejunum it was much higher. The K current across the rumen decreased after addition of TAP as a paracellular blocker, and after addition of the K channel blockers barium chloride and verapamil. In abomasum, barium chloride decreased the K current, while TAP had no effect. In jejunum, TAP and barium decreased the K current.
Neither TAP nor barium showed any effect in colon. Thus, the mechanisms of potassium absorption are apparently different. While electrogenic K transport seems to dominate in rumen and colon, K absorption across abomasum and jejunum ruminants are likewise able to contribute to K absorption, if the luminal availability of K is increased [1,4,5]. Increasing the K level in the diet from 15.29 to 169.48 g/d increased the preintestinal K absorption by 81.49 g/d in steers [4]. In cows an increase in K uptake from 200 to 360 g/d increased the preintestinal K absorption by 72.3 g/d [5]. Based on their results Khorasani et al. [5] postulated a positive linear relationship between K intake and K net absorption before the small intestine.
Previous studies in sheep [6] have likewise shown that an increase in luminal K concentration between 35 and 100 mmol∙l-1 caused a linear increase in K absorption from the rumen. In vitro studies have up to now only be performed in the absence of transepithelial K gradients and show a small K secretion across rumen epithelium under these conditions [7,8]. V. Engelhardt et al. [9] observed a secretion of K via the epithelium of abomasum in goats, without seeing any noteworthy net absorption across the abomasal mucosa. In abomasal pouches of sheep no K absorption was observable [10].
Cows that suffer from abomasal displacement, a disease mainly found in high yielding dairy cows around parturition, often show a (sometimes severe) hypokalemia
[11-15] which is associated with other injuries like hypochloremia, alkalemia and low feed intake [16]. This drop in plasma K might be the cause as well as the consequence of abomasal displacement. A reduction in feed intake can decrease plasma K by 0.6 meq∙l-1 [17]. Hormones such as adrenaline or insulin can shift K from extra- to intracellular compartments [18,19], while high levels of aldosterone or the corticosteroid isoflupredone-21-acetate are able to increase renal K excretion [20]. All these circumstances will entail a reduction in plasma K, and we have shown recently, that a reduction in extracellular K concentration decreases the contraction activity of abomasal muscles [21]. On the other hand, many researchers postulate that the reduction in plasma K develops secondary to abomasal displacement as a consequence of reduced K absorption from the intestine [11,22,23]. Since our knowledge about the mechanisms of gastrointestinal K absorption is very limited, it was the aim of the present study to investigate K absorption across different gastrointestinal epithelia from ruminants.
4.3 Methods 4.3.1 Tissues
The tissues were from common german breeds, taken in a slaughterhouse. Parts of the ventral rumen wall, the abomasal corpus, mid jejunum and proximal colon were taken from goat, sheep and cattle immediately after slaughter and immediately immersed in buffer solution. The mucosa was stripped from the underlying muscle layers and the serosa. Isolated epithelia were used for Ussing chamber experiments.
The tissues were from common german breeds, taken in a slaughterhouse. Parts of the ventral rumen wall, the abomasal corpus, mid jejunum and proximal colon were taken from goat, sheep and cattle immediately after slaughter and immediately immersed in buffer solution. The mucosa was stripped from the underlying muscle layers and the serosa. Isolated epithelia were used for Ussing chamber experiments.