Versuchsdurchführung

3.3.1 Versuch 1: In-vitro-Inaktivierungskinetik und -Photoreaktivierung

Für die In-vitro-Inaktivierungskinetiken wurden 9 ml Bakteriensuspension der jeweiligen Spezies (Y. enterocolitica M52+2, Y. enterocolitica DSM 11503, B. thermosphacta DSM 20171, P. fluorescens 63 A, S. Typhimurium DSM 19587, MRSA 02702-07, EHEC CB8601) in einer Petrischale (90 mm Durchmesser) im UV-Schrank bestrahlt. Um auf eine Menge von 9 ml zu kommen, wurden mehrere Suspensionen (vorbereitet wie unter 3.1) gemischt und der McFarland Trübungsstandard wieder auf 1,0 eingestellt. Die Petrischale wurde 40 cm unter der UV-Lampe platziert. Die Proben wurden entweder mit 3,5, 7, 14, 21 oder 28 mJ/cm² bzw. für Y. enterocolitica DSM 11503 mit 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 oder 0,24 mJ/cm² bestrahlt. Da sich Y. enterocolitica DSM 11503 deutlich sensibler gegenüber der UV-C-Strahlung zeigte als die anderen in dieser Studie verwendeten Mikroorganismen, mussten geringere UV-Dosen gewählt werden, um eine Inaktivierungskinetik darzustellen. Für jede Dosis wurde eine neue Petrischale vorbereitet. Die Keimzahl der unbehandelten Probe (0 mJ/cm²) wurde ebenfalls bestimmt. Nach der Bestrahlung wurden Verdünnungsreihen auf Plate-Count-Agar (Oxoid, GmbH, Wesel, Deutschland) angelegt und bei 30 °C für 24 Stunden inkubiert. B. thermosphacta wurde für 48 Stunden bei 25 °C auf Columbia Agar mit Schafblut inkubiert, da der Keim kein gutes Wachstum auf Plate-Count-Agar zeigte.

Um den Effekt der Photoreaktiverung von Y. enterocolitica M52+2, Y. enterocolitica DSM 11503 und B. thermosphacta DSM 20171 in-vitro zu bestimmen, wurde der Keimgehalt der Proben sowohl direkt nach der Bestrahlung als auch nach einer Stunde Lichtexposition mit sichtbarem Licht analysiert.

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3.3.2 Versuch 2: Inaktivierungskinetik auf Schweinefleisch und Lachsschinken Für die Inaktivierungsversuche wurden Schweinefleisch und Lachsschinken aus verschiedenen Chargen in einem lokalen Supermarkt erworben. Bei dem Schweinefleisch handelte es sich um Minutensteaks (Scheiben aus dem Musculi longissimi thoraces et lumborum), die unter Schutzatmosphäre verpackt waren. Die Lachsschinken-Proben waren ebenfalls unter Schutzatmosphäre verpackt. Eine Packung enthielt 100 g Scheiben des Lachsschinkens.

Bakteriensuspensionen von Y. enterocolitica M52+2 und B. thermosphacta DSM 20171 wurden wie in 3.1 vorbereitet. Für die Versuche mit einer geringeren Inokulationsmenge (nur bei Lachsschinken) wurde die Bakteriensuspension noch weiter verdünnt, sodass sie nur 10⁶ KbE/ml enthielt. Ein Volumen von 0,5 ml der Suspension (mit einer Konzentration von entweder 10⁸ oder 10⁶ KbE/ml) wurde auf die Probe aufgebracht und gleichmäßig mit einem Spatel (VWR International, Darmstadt, Deutschland) verteilt. Nach einer Einwirkzeit von 20 min wurden die Proben mit Dosen von 408, 2040, 4080 oder 6120 mJ/cm² bestrahlt. Diese Dosen haben sich in Vorversuchen als wirkungsvoll erwiesen. Direkt nach der Bestrahlung erfolgte die mikrobiologische Untersuchung der Proben.

3.3.3 Versuch 3: Lagerungsversuch Material

Für die Schweinefleisch-Versuche wurden fünf linke Musculi longissimi thoraces et lumborum (LM) weiblicher Tiere einer kommerziellen Schweinegenetik 24 h nach der Schlachtung vom Schlachthof Gramann Ahrberg, Pattensen erworben. Weitere drei LM wurden für die Lachsschinken-Versuche erworben und direkt zu Lachsschinken weiterverarbeitet.

Das Fleisch wurde zunächst von oberflächlichem Binde- und Fettgewebe befreit.

Danach wurden zur Charakterisierung des Fleisches Fleischstücke zwischen dem 13.

und 14. Wirbel herausgeschnitten und der pH-Wert, die Leitfähigkeit, der Tropfsaftverlust, der Kochverlust sowie die Scherkraft ermittelt. Vor diesen Messungen wurden Proben zur Bestimmung der Gesamtkeimzahl (GKZ) und der Anzahl an Enterobacteriacea, Yersinia spp. und Brochothrix spp. entnommen.

25 Zur Weiterverarbeitung zu Lachsschinken wurden die drei LM zunächst mit einem Salzgemisch aus 5 % Natriumchlorid und 0,025 % Natriumnitrit behandelt, vakuumverpackt und bei 4 °C gelagert. Nach 14 Tagen wurde das Fleisch aus der Verpackung entnommen und für weitere 4 Wochen bei 4 °C im Hängen gelagert. Nach der Lagerung wurden zunächst zur Grundcharakterisierung die Farbe und die Wasseraktivität bestimmt und Proben zur Bestimmung der Wasser-, Protein-, Fett-, Asche-, Salz- und Nitritgehalte entnommen, homogenisiert und bis zur Analyse bei - 20 °C gelagert. Weiterhin wurde vor diesen Messungen und Probennahmen Proben für die Bestimmung der GKZ sowie der Gehalte an Enterobacteriaceae, Yersinia spp.

und Brochothrix spp. entnommen.

Für die UV-Versuche wurde das Schweinefleisch in 25 g Stücke und der Lachsschinken in Scheiben mit einer Dicke von 1,5 mm und einem Gewicht von ca.

10 g portioniert.

Behandlung

Bakteriensuspensionen von Y. enterocolitica M52+2 und B. thermosphacta DSM 20171 wurden wie in 3.1 beschrieben hergestellt. Ein Volumen von 0,5 ml der Bakteriensuspension wurde auf die Schweinefleisch- oder Lachsschinkenstücke übertragen und mit einem Spatel gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt. Nach einer Einwirkzeit von 20 min wurden die Proben im UV-Schrank bestrahlt. Sie wurden dafür in einem Abstand von 10 cm zur UV-Lampe positioniert. Die Schweinefleisch-Proben wurden mit Dosen von 408 oder 2040 mJ/cm² und die Lachsschinken-Proben mit Dosen von 408 oder 4080 mJ/cm² bestrahlt. Die Dosen wurden aufgrund von guten Keimreduktionen in den Vorversuchen ausgewählt.

Die behandelten und unbehandelten (Kontroll-) Proben wurden anschließend unter Schutzgasatmosphäre (Schweinefleisch: 30 % CO2, 70 % O2; Lachsschinken: 30 % N2, 70 % O2) in Plastikschalen (ES-Plastic GmbH, Hutthurm, Deutschland) verpackt und bis zur weiteren Analyse bei 7 °C gelagert. Am Behandlungstag (Tag 1 bei Schweinefleisch und Tag 0 bei Lachsschinken) sowie an den Tagen 7 und 14 wurden die Proben analysiert. Das Vorkommen von Y. enterocoliticia und B. thermosphacta sowie bei den Nativproben zusätzlich die GKZ und Enterobacteriaceae wurde

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quantitativ mikrobiologisch untersucht. Bei den Versuchen mit frischem Schweinefleisch wurden weiterhin die Parameter Farbe und pH-Wert bestimmt und Proben für die Bestimmung der Anteile der Myoglobin-Redoxformen und der antioxidative Kapazitäten der verschiedenen Behandlungsgruppen entnommen und bei -20 °C (antioxidative Kapazität) bzw. -80°C (Myoglobin) bis zur Analyse gelagert.

Die Lachsschinken-Proben wurden auf ihre Farbe untersucht und Proben für die Analyse der antioxidativen Kapazität entnommen und bei -20°C bis zur Bestimmung gelagert.

Die derartig untersuchten und beprobten Proben wurden von den weiteren Experimenten ausgeschlossen.

3.3.4 Versuch 4: Photoreaktivierung auf Schweinefleisch und Lachsschinken Schweinefleisch und Lachsschinken aus drei verschiedenen Chargen wurden in einem lokalen Supermarkt erworben.

Schweinefleischstücke von ca. 25 g bzw. Scheiben des Lachsschinkens wurden mit 0,5 ml einer Bakteriensuspension (entweder von Y. enterocolitica M52+2 oder B. thermosphacta DSM 20171) inokuliert und nach einer Einwirkzeit von 20 min mit 408 oder 2040 mJ/cm² (Schweinefleisch) bzw. 4080 mJ/cm² (Lachsschinken) bestrahlt. Für eine Probengruppe wurde die Keimzahl direkt nach der Bestrahlung bestimmt. Die anderen beiden Gruppen wurden gekühlt auf Eis eine Stunde lang gelagert, bevor sie quantitativ untersucht wurden. Eine Gruppe wurde im Raumlicht, die andere abgedeckt im Dunkeln gelagert.

3.4 Mikrobiologische Untersuchung

Die Proben wurden in Stomacher Beuteln (Stomacher 400 Strainer Bags, Seward limited, Worthing, Großbritannien) mit einem Stomacher (Stomacher 400 Circulator, Seward) in einer Verdünnung von 1:10 mit steriler NaCl-Pepton-Lösung (0,85 % NaCl und 0,1 % Pepton) für 2 min bei 230 Schlägen/min homogenisiert. Anschließend wurden Verdünnungsreihen erstellt.

27 Die Untersuchung der Keime erfolgte nach ISO 4833-1:2013 (GKZ), ISO 21528:2017 (Enterobacteriaceae), ISO 10273:2017 (Yersinia spp.) und nach HECHELMANN (1981) für Brochothrix spp.

Für die Analyse von Y. enterocolitica und B. thermosphacta wurden 0,1 ml der Verdünnung auf CIN-Agarplatten (Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin-Agar, Oxoid) bzw.

SIN-Agarplatten (Streptomycin-Inosit-Neutralrot-Agar, Oxoid) aufgetragen und mit einem Spatel gleichmäßig verteilt. Die Platten wurden für 24 h bei 30 °C bzw. 48 h bei 24 °C inkubiert.

Zur Untersuchung der GKZ und der quantitativen Bestimmung von Enterobacteriaceae wurde 1 ml der Verdünnung in eine Petrischale gegeben und anschließend mit Plate-Count-Agar (Oxoid) bzw. VRGB-Agar (Kristallviolett-Galle-Glucose-Agar, Oxoid) übergossen. Die Platten wurden für 72 h bei 30 °C bzw. 48 h bei 37 °C gelagert.

3.5 Physikochemische Untersuchung