Trotz dieses relativ eindeutigen Ergebnisses bleibt ein Aspekt ungeklärt. Die in vivo-Beobachtungen haben eine Notwendigkeit der Cue1CUE-Domäne für den Abbau einer bestimmten Subpopulation von Substratproteinen gezeigt. Könnte es daher
sein, dass die Interaktion eines speziellen Substrats mit der Ligase und dem eben-falls daran gebundenen Ubc7-Cue1-Heterodimer den Komplex so verändert, dass Ubc7 zu Konjugation verschieden verknüpfter Ubiquitinketten angeregt wird? Zwar wurden Versuche unternommen, ein Substratprotein in die in vitro Ubiquitinierungs-reaktion einzubringen, jedoch blieben diese Proteine nach Inkubation mit den Reak-tionspartnern unkonjugiert. Das heißt, es konnten keine Ubiquitinketten auf den Substraten nachgewiesen werden. Weder natives noch hitzedenaturiertes CPY, BSA oder RNaseA wurden in einer Reaktion mit Ubc7, Cue1 und Hrd1 modifiziert. Auch der lösliche Teil von Ubc6 oder aufgereinigtes Deg1-cNLS-GFP-GFP-His6 wurden nicht durch Inkubation mit Ubc7, Cue1 und Doa10 ubiquitiniert. Es musste jedoch auch die Möglichkeit miteinbezogen werden, dass Ubc7 die Substrate nicht de novo ubiquitiniert, sondern nur auf bereits monoubiquitinierte Proteine kettenverlängernd wirkt.
Bei den eingangs beschriebenen in vitro Ubiquitinierungen, ohne Zugabe eines Sub-stratproteins, ubiquitinierte Ubc7 lediglich ein anderes Ubiquitinmolekül, das entwe-der als Monomer oentwe-der aber als letztes Glied einer Ubiquitinkette vorlag. Theoretisch sollte Ubc7 also auch ein monoubiquitiniertes Protein polyubiquitinieren können. Eine Fusion aus dem Doa10-abhängigen Substrat Deg1-cNLS-GFP-GFP-His6 und einem Ubiquitin sollte den Beleg dafür liefern. In Abbildung 15 sind hierzu zwei in vitro Ubiquitinierungsreaktionen dargestellt.
Beide Reaktionen enthielten sowohl Ubc7, Cue1, Doa10 und freies Ubiquitin. Der ersten Reaktion wurde zusätzlich Deg1-cNLS-GFP-GFP-His6 (pUL 063), der zweiten die Fusion Deg1-cNLS-GFP-Ub-His6 (pUL 067) zugesetzt. Im Immunblot gegen das zugegebene Ubiquitin sind für beide Reaktionen neben Ubiquitin-Monomeren und – Dimeren auch Ubiquitinketten sichtbar. Leider scheint es sich hierbei erneut um
„freie“ Ubiquitinketten zu handeln. Der Immunblot zum Nachweis des GFP-fusionierten Deg1-Substrats zeigt sowohl für die nicht-Ubiquitin-fusionierte Form als auch für die Ubiquitinfusion keine Signale, die der Anheftung eines weiteren Ubiquitinmoleküls zugeordnet werden könnten. Das mit * gekennzeichnete, im Im-munblot erkennbare Signal oberhalb des Deg1-Substrats ist nachweislich kein Resul-tat der in vitro Ubiquitinierungsreaktion sondern wahrscheinlich ein Artefakt der hete-rologen Expression in E. coli bzw. der Proteinaufreinigung. Die Konzentration und die unterschiedliche Affinität des freien Ubiquitin und des Ubiquitin-Fusionsproteins zum E1 und E2 könnten die Ursache für eine fehlende Ubiquitinierung auf dem
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cNLS-GFP-GFP-Ub-His6 sein. Möglicherweise ist die Affinität des relativ großen Deg1-Ubiquitin-Fusionsproteins zum Ligasekomplex deutlich geringer als die der freien Ubiquitinmoleküle. Dann müsste eine wesentlich höhere Menge des Fusions-proteins eingesetzt werden, um einen Effekt beobachten zu können.
Abbildung 15: Ubiquitinierung von Deg1-cNLS-GFP-GFP-His6 bzw. Deg1-cNLS-GFP-GFP-Ub-His6 in vitro. Reaktion der aus E. coli aufgereinigten Deg1-Fusionen mit Ubc7, Cue1 und Doa10 sowie Flag-Ub. Inkubation der Proben für 15 min bei 30 °C. * zeigt die durch die Aufreinigung der Deg1-Fusionsproteine bedingten zusätzlichen Signale für die jeweiligen Proteine an.
Ein weiteres Hindernis könnte die generelle Bindung eines Substrats durch die Ubiquitinligasen darstellen. Wie bereits erklärt, wurden die Ligasen in E. coli ohne ihre jeweiligen Transmembranbereiche exprimiert. Wenn die Substratproteine nicht im Bereich des RING-Fingers mit der Ligase interagieren, werden sie als Folge des-sen in einer in vitro Reaktion auch nicht ubiquitiniert. Eine andere Möglichkeit, den Ubiquitinierungsprozess am Doa10-Ligase-Komplex näher zu betrachten, bietet das Protein Ubc6. Dieses ist nicht nur ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym der Doa10-Ligase sondern gleichzeitig ein Substratprotein, welches in Abhängigkeit der katalyti-schen Aktivität von Ubc6 und Ubc7 polyubiquitiniert und anschließend abgebaut wird.
Um jedoch die Ubiquitinierung von Ubc6, als Substrat, durch Ubc7, Cue1 und Doa10 untersuchen zu können, musste festgestellt werden, wie sich das Protein als Ubiquitin-konjugierendes Enzym an der Ligase verhält. Hierzu wurde zunächst eine in vitro Ubiquitinierung mit Doa10 und Ubc6 bzw. der katalytisch inaktiven Variante, C(87)S, von Ubc6 betrachtet (Abb. 16A). Wie erwartet, zeigen Doa10 und Ubc6C(87)S allein und in Kombination keinerlei Ubiquitinierungsaktivität. Eine Reak-tion von aktivem Ubc6 mit Ubiquitin offenbart hingegen, dass durch E1 aktiviertes Ubiquitin mit Ubc6 wechselwirkt und auf Ubc6 kovalent verknüpft wird.
Wie im α-Ubc6-Immunblot erkennbar, erzeugt die Interaktion des Ubiquitin mit Ubc6 eine Konjugation eines einzelnen Ubiquitin auf Ubc6. Diese ist stabiler als eine Thio-esterbindung, da eine Behandlung der Proben mit DTT-haltigem Probenpuffer keinen Verlust des Signals der Ubc6-Ubiquitinverbindung bedeutet. Auch im α -Flag-Immunblot ist das Signal für eine Ubc6-Ubiquitinverknüpfung deutlich nachweisbar.
Die Zugabe von Doa10 ändert an dieser Reaktion anscheinend nichts. Es findet we-der eine Synthese von freien owe-der konjugierten Ubiquitinketten statt, noch wird Doa10 mit Ubiquitin modifiziert.
Abbildung 16: Ubiquitinierungsaktivität des Ubc6 in vitro und dessen Verhalten als Substrat-protein. A: Ubiquitinierungsreaktion von Ubc6 oder dessen katalytisch inaktiver Variante C(87)S in Ab- und Anwesenheit von Doa10. Inkubation im Reaktionspuffer für 15 min. B: Ubiquitinierung in Reaktio-nen mit aktivem Ubc6 als E2-Enzym oder Substrat. 20 min Inkubation.
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Anscheinend beeinflusst der Doa10-RING-Finger die Aktivität von Ubc6 in diesem Versuch in keiner Weise. Dies könnte erneut auf die fehlende Co-Lokalisierung bei-der Enzyme zurückzuführen sein. Ubc6 als Ubiquitin-konjugierendes Enzym sollte zwar mit dem RING-Finger der Ligase interagieren, jedoch ist Ubc6 in den Hefezellen durch seinen eigenen Transmembrananker in der ER-Membran und somit in räumli-cher Nähe zu Doa10 lokalisiert. Diese Konzentration der beiden Proteine an einer Membran fehlt in der in vitro Reaktion. Somit kann weder eine Aussage über die Akti-vität von Ubc6 mit Doa10 getroffen werden, noch kann Ubc6 als Substrat in einer Ubiquitinierungsreaktion mit Ubc7 und Cue1 an der Doa10-Ligase untersucht wer-den. Tatsächlich bleibt Ubc6 in einer Reaktion mit Cue1 und Ubc7 und auch nach zusätzlicher Zugabe von Doa10, wie im α-Ubc6-Immunblot der Abbildung 16B dar-gestellt, bis auf die Auto-Monoubiquitinierung unmodifiziert. Ein Immunblot gegen das eingesetzte epitopmarkierte Ubiquitin weist erneut die Ubc6-Ubiquitin-Verknüpfung auf sowie die freien Ubiquitinketten, die aus der Reaktion von Ubc7 mit Cue1 und Doa10 hervorgehen.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass weder Deg1-GFP oder eine Ubiquitinfusion dieses Proteins, noch Ubc6 als Substrat zur Untersuchung der Ubiquitinierungsvorgänge an der Doa10-Ligase geeignet sind, vermutlich, da keine ausreichende Interaktion der Substrate mit dem Ligasekomplex erreicht wird. Aus diesem Grund kann nicht geklärt werden, ob die Cue1-CUE-Domäne in vivo eine funktionelle Bedeutung bei der Ubiquitinierung und dem Abbau spezieller Substrat-proteine hat.
2.14 Ubc6 verknüpft Ubiquitinmoleküle über das Lysin an Position 11