Um den Doa10-Ligasekomplex mit den daran gebundenen Interaktionspartnern zu immobilisieren und aufzureinigen, wurden Hefestämme verwendet, in denen Doa10 aminoterminal mit einem 13-fachen myc-Epitop markiert war. Aus Abbildung 9A ist ersichtlich, dass, nach Solubilisierung der präparierten Hefemembranen mit 1 % Di-gitonin, die zu betrachtenden, einst membrangebunden oder membranassoziierten Proteine quantitativ aus den Membranen herausgelöst wurden. Des Weiteren waren alle Ubc7-Varianten in etwa gleicher Menge im Lysat vorhanden, was aus dem Im-munblot gegen Ubc7 hervorgeht. Dieser ImIm-munblot zeigt auch, dass in der ubc7∆al-Mutante das Ubc7-Protein ein im Vergleich zum UBC7-Wildtyp verändertes Bin-dungsverhalten an die Ligase aufweist: Während das Wildtyp-Ubc7 lediglich eine geringe Bindung an Doa10 erkennen lässt, scheint die Ubc7∆al-Variante stärker mit der Ligase assoziiert zu sein. Auch bei den Ubc7-Varianten mit Punktmutationen in-nerhalb der sauren Schleife, D2 und D2E2, ist im Vergleich zum Wildtyp eine leicht höhere Ligaseinteraktion sichtbar. In ubc7∆al-Zellen sind auch Cue1 und Ubc6 ver-stärkt mit der Ligase assoziiert. Die starke Interaktion des Cue1 mit der Ligase lässt sich durch dessen Komplexbildung mit Ubc7 bzw. den Ubc7-Varianten erklären.
Ubc6 liegt in ubc7∆al-Zellen stabilisiert vor und weist daher eine erhöhte Menge so-wohl in den solubilisierten Membranen als auch im Präzipitat mit Doa10 auf. Überra-schenderweise interagiert auch die katalytisch inaktive C(89)S-Variante von Ubc7 mit der Ligase, obwohl sie keinen Thioester mit Ubiquitin formen kann. Demzufolge scheint die Beladung des Ubc7 mit Ubiquitin keine Voraussetzung für dessen Rekru-tierung an die Doa10-Ligase zu sein.
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Abbildung 9: Zusammensetzung der ERAD-Ligasekomplexe in ubc7-Mutanten. Immunpräzi-piation der myc-epitopmarkierten Ligase Doa10 (A) oder des HA-epitopmarkierten Hrd1-assoziierten Proteins Hrd3 (B) aus solubilisierten Membranen äquivalenter Mengen an Hefezellen. Immunoblotting der co-präzipitierten Proteine.
Für die Betrachtung der Verhältnisse am Hrd-ligase-Komplex (Abb. 9B) wurden He-fen mit aminoterminal 3-fach HA-epitopmarkiertem Hrd3 verwendet und die mit der Hrd1-Ligase komplexierten Proteine nach Membransolubilisierung und Immunpräzi-pitation mittels Antikörpern detektiert. Auch hier scheint die Ubc7∆al-Variante eine stärkere Bindung mit dem Ligasekomplex einzugehen, wenn auch die Menge von Ubc7∆al in der Membran im Vergleich zu den anderen Ubc7-Varianten insgesamt schon etwas erhöht ist. Die Assoziation des Ubc7-Wildtyp mit der Ligase kann hinge-gen nahezu nicht detektiert werden. Die Ubc7-Varianten D2, E2 und D2E2 sind in nachweisbarer Menge an den Ligasekomplex gebunden. Eine Ursache für die kaum detektierbare Interaktion des Ubc7-Wildtyp mit der Hrd-Ligase könnte in der Kurzle-bigkeit dieser Wechselwirkung liegen. Dies würde das Modell unterstützen, dass nur
ein Austausch eines unbeladenen gegen ein beladenes E2-Enzym die Prozessivität der Ubiquitinkettenbildung gewährleistet, wobei das mit Ubiquitin beladene E2 eine hohe und das unbeladene E2 eine geringe Affinität zur Ligase hätte. Die verstärkte Interaktion des Ubc7∆al mit der Ligase würde hiernach einer Situation entsprechen, in der ein mit Ubiquitin beladenes E2 an die Ligase rekrutiert wird, jedoch die Über-tragung des Ubiquitin auf ein bereits initial ubiquitiniertes Substrat aufgrund der Muta-tion in der sauren Schleife des Ubc7 nicht erfolgen kann. Folglich bliebe eine starke Bindung des E2 zur Ligase erhalten.
Die Interaktion von Ubc7∆al mit der Ligase ist lediglich verstärkt aber nicht irreversi-bel. Dies zeigen Ergebnisse eines Versuches zum Abbau von Ubc6 und CPY*, bei dem in ubc7∆al-Zellen zusätzlich das Wildtyp-UBC7 exprimiert wurde (ohne Abbil-dung). Für beide Substratproteine konnte unter diesen Bedingungen ein im Vergleich zum Wildtyp verlangsamter aber deutlich erkennbarer Abbau nachgewiesen werden.
Das Bindungsverhalten von Ubc7 an die Hrd1-Ligase korreliert nicht zwangsläufig positiv mit dem Substratabbau, was aus der Interaktion des Cdc48 mit der Ligase ableitbar ist. Unter Wildtyp-Bedingungen mit normaler Ubiquitinierungsaktivität wird über Ubx2 eine bestimmte Menge an Cdc48 an die Ligase rekrutiert, um die mit Ubiquitin markierten Proteine aus dem membrangebundenen Komplex herauszulö-sen und ins Zytosol zu entlasherauszulö-sen. In Zellen, in denen ubc7 deletiert und demzufolge die Anzahl ubiquitinierter Proteine deutlich reduziert ist, wird nur sehr wenig Cdc48 an den Ligasekomplex gebracht. Dies gilt auch für die ubc7-Mutante mit deletierter saurer Schleife, was Rückschlüsse auf eine gestörte Ubiquitinkettenbildung in diesen Zellen erlaubt. Und erneut kann für die Punktmutanten ubc7D2 und ubc7E2 auch in dieser Hinsicht ein intermediärer Phänotyp festgestellt werden.
Die Ergebnisse der in vitro und in vivo Untersuchungen belegen deutlich, dass, wie für Cdc34 beschrieben, die saure Schleife in Ubc7 eine entscheidende Rolle bei der Ubiquitinkettenbildung auf Substratproteinen spielt. Bereits die Veränderung zweier benachbarter Aspartat-Reste zu Alanin zeigt eine im Vergleich zum Wildtyp signifi-kant reduzierte in vitro Ubiquitinierungsaktivität. Darüber hinaus ist das Vorhanden-sein der sauren Schleife eine Voraussetzung für den Abbau von Proteinen, da eine unzureichende Substratubiquitinierung die Rekrutierung des Cdc48 an die Ligase-komplexe verringert und somit der Transfer der Substrate zum 26S Proteasom stark eingeschränkt ist.
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2.7 Wirkung von Cue1 und der Cue1-CUE-Domäne auf die