Ausgehend von der Annahme, dass die für CUE-Domänen beschriebene Funktion der Ubiquitinbindung zutrifft, müsste der Einfluss der Cue1-CUE-Domäne auf die Ge-schwindigkeit der Polyubiquitinierung und die Länge der Ketten auf einen Defekt bei der Bindung von Ubiquitin zurückzuführen sein. Wie bereits erwähnt, wurde für Cue1 bislang nur eine sehr geringe Ubiquitin-bindende Fähigkeit beobachtet. Für eine bes-sere Einschätzung dieser Resultate wurde die Bindung von Ubiquitin an Cue1 erneut untersucht (Abb. 11A). Einige ubiquitinbindenden Domänen haben Präferenzen für Mono- oder Polyubiquitin bzw. für Ubiquitinketten, die über einen bestimmten Lysin-rest miteinander verknüpft sind. Um zu untersuchen, ob Cue1 ebenfalls eine Präfe-renz für bestimmte Ubiquitinketten aufweist, wurden prä-assemblierten Ubiquitinket-ten gekauft (zwei bis sieben konjugierte Ubiquitinmoleküle, Ub2-Ub7), die entweder eine Lysin48-Verknüpfung oder aber eine Lysin63-spezifische Verknüpfung aufwie-sen. Die Qualität der käuflich erworbenen Ubiquitinketten differierte zum Teil erheb-lich. Bei den K48-Ketten waren statt sieben konjugierter Ubiquitinmoleküle häufig nur Ub5-Ketten nachweisbar. Die K63-Ketten zeigten hingegen auch längere Verknüp-fungen. Die zu untersuchenden Cue1-Varianten, aber auch die UBA-Domäne von Dsk2 wurden als GST-Fusionen exprimiert und durch Bindung an Glutathion-SepharoseTM immobilisiert. Für die UBA-Domäne von Dsk2 konnte in früheren Expe-rimenten eine sehr gute Ubiquitinbindung festgestellt werden, weshalb sie in diesem Versuchsaufbau als Positivkontrollen diente. Die immobilisierten GST-Fusionsproteine wurden in einer Lösung mit den verschiedenen Ubiquitinketten inku-biert, gewaschen und anschließend auf die Menge des gebundenen Ubiquitins hin untersucht (P). Auch wurde nach der Inkubation getestet, wie viel nicht gebundenes Ubiquitin im Überstand verblieben ist (Ü).
Aus dem Immunblot gegen GST in Abbildung 11A geht hervor, dass die verschiede-nen GST-Fusionsproteine in etwa vergleichbarer Menge in den Proben vorlagen. Al-lerdings zeigen sich bei einigen Fusionsproteinen niedermolekulare Abbauprodukte sowie GST allein. Um eine Bindung des Ubiquitins an GST auszuschließen, diente aufgereinigtes immobilisiertes GST in dieser Bindungsstudie als Negativkontrolle.
Der Immunblot gegen Ubiquitin belegt, dass GST allein weder Lysin48-verknüpftes noch Lysin63-verknüpftes Polyubiquitin bindet (P). Infolge dessen verblieb nach der Inkubation sämtliches Ubiquitin im Überstand (Ü). Untersucht man die Fähigkeit der
Cue1-Fusionsproteine Cue1∆TM (WT) sowie die carboxyterminale Verkürzung von Cue1 (174) Lys48-verknüpftes Ubiquitin zu binden, so befindet sich das Ubiquitin nach der Inkubation in der Pelletfraktion. Dies belegt einerseits, dass Cue1 prinzipiell in der Lage ist Polyubiquitin zu binden, und andererseits zeigt es, dass die Ubc7-bindende Region in Cue1 nicht zu dieser Fähigkeit beiträgt. Hiermit wird die ubiquitinbindende Funktion von Cue1 klar von der Ubc7-rekrutierenden Funktion ge-trennt. Ein gewisser Anteil an Ubiquitin in den Überstands-Proben nach der Inkubati-on, könnte auf ein geringes Bindungsvermögen der Cue1-Varianten hinweisen, oder aber es liegt eine Sättigung der Cue1-Moleküle vor. In diesem Fall wären mehr Ubiquitinketten vorhanden als Cue1-Moleküle, die diese binden. Diese Überlegungen lassen sich teilweise durch Betrachtung der Ubiquitinbindung an die Dsk2-UBA-Domäne besser einschätzen. Im Vergleich zum WT-Cue1 scheint die UBA-Dsk2-UBA-Domäne doch etwas mehr Ubiquitin gebunden zu haben, auch wenn hier ebenfalls ein gerin-ger Anteil kurzer Ubiquitinketten im Überstand verbleibt. Dies lässt auf ein im Ver-gleich zu Dsk2 etwas geringeres Ubiquitin-Bindungsvermögen des Cue1 schließen.
Allerdings scheinen unter diesen Versuchsbedingungen die Unterschiede nicht so gravierend zu sein wie angenommen.
Anhand der untersuchten Cue1-Varianten mit fehlerhafter CUE-Domäne in diesem Experiment zeigt sich, dass keine dieser 3 Varianten Ubiquitin bindet. Ein Aminosäu-reaustausch (LAP zu RGA) in der für andere CUE-Domänen konservierten Region genügt, um die Bindung von Lys48-verknüpften Ubiquitin an Cue1 völlig zu unterbin-den. Allerdings konnte auch der exprimierte Bereich der minimalen CUE-Domäne (CUE domain) nicht mit den Ubiquitinketten interagieren – das Ubiquitin liegt hier vollständig im Überstand vor. Es wäre durchaus denkbar, dass die als GST-Fusion aufgereinigte CUE-Domäne nicht ihre native Faltung erlangt hat und deshalb die Fä-higkeit Ubiquitin zu binden nicht vorhanden ist. Ein weiterer Grund für die fehlende Ubiquitinbindung könnte an der Auswahl der Sequenz bzw. der Abgrenzung der CUE-Domäne liegen. Wie erwähnt, wurde für die Expression der Domäne ein Be-reich gewählt, der laut Strukturvorhersage eine minimale CUE-Domäne repräsentiert.
Vielleicht sind jedoch auch Aminosäuren außerhalb dieses Bereichs für deren Funk-tion notwendig.
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Abbildung 11: Bindung und Schutz von Ubiquitinketten durch die Cue1CUE-Domäne. A: In vitro Bindung von prä-assemblierten Ubiquitinketten an verschiedene immobilisierte GST-Cue1-Fusionen und die UBA-Domäne von Dsk2. Analyse von Überstand (Ü) und immobilisiertem Material (P) nach 4-stündiger Bindung bei 4 °C. * markiert das Signal für GST-Dsk2-UBA im anti-Ub-Immunblot. B,C: Inkubation von K48-verknüpften Ubiquitinketten mit BSA, WT-Cue1 oder der RGA-Variante auf Eis. Analyse des Kettenabbaus nach Zugabe des humanen deubiquitinierenden Enzyms Otubain1 in einem Zeitraum von 240 s. Rechter und linker Immunblot entstammen demselben Expe-riment. C:Abnahme des Diubiquitin bei gleichzeitiger Zunahme des Monoubiquitin.
Analysiert man die Bindung von Lys63-verknüpfen Ubiquitinketten, so zeigt sich ein ähnliches Bild wie bei den Lys48-verknüpften Ketten. WT-Cue1 bindet die
Ubiquitin-ketten, während die RGA-Variante diese Fähigkeit verloren hat. Erstaunlicherweise bindet die Dsk2-UBA-Domäne zwar Lys63-verknüpftes Ubiquitin, diese Bindung scheint jedoch schwächer zu als die Bindung der Lys63-verknüpften Ketten an Cue1.
Es bleibt zu spekulieren, ob die Cue1-CUE-Domäne tatsächlich eine höhere Affiinität für Ubiquitinketten aufweist, die nicht über Lys48 verknüpft sind. Leider war es aus technischen Gründen (Mangel an verschiedenen prä-assemblierten Ubiquitinketten) nicht möglich, die Bindung weiterer, unterschiedlicher Ubiquitinketten an Cue1 zu untersuchen. Sofern geeignete Ketten verfügbar wären, könnte z.B. eine Biacore-Bindungsstudie Aufschluss über die differenzierte Affinität des Cue1 zu Ubiquitinket-ten verschiedener Verknüpfung und Länge geben.
2.9 Die CUE-Domäne schützt Polyubiquitinketten partiell vor