Die in vitro Experimente offenbarten, dass die Deletion der CUE-Domäne einen Ein-fluss auf die Polyubiquitinierung durch Ubc7 an einer Ligase hat. Doch wie wirkt sich eine Deletion der CUE-Domäne an einem Ligasekomplex in vivo aus? Durch Im-munpräzipitation einer Ligase und die Co-Präzipitation der interagierenden Enzyme und Adapterproteine sollten die Vorgänge genauer untersucht werden. Aufgrund der im Vergleich zur Hrd1/Hrd3-Immunpräzipitation besseren Detektierbarkeit der ligase-assoziierten Faktoren an der Doa10-Ligase, wurde, nach Expression verschiedener cue1-Mutanten, aminoterminal myc-epitopmarkiertes Doa10 mittels eines anti-myc Antikörpers gefällt und die Zusammensetzung des Ligasekomplexes betrachtet (Abb.
12). Im Anschluss an den Zellaufschluss wurden die Membranen präpariert und solu-bilisiert. Wie in der linken Hälfte der Abbildung erkennbar, wurden das Plasmid-kodierte Wildtyp-CUE1 ebenso gut exprimiert wie das endogene, chromosomal ko-dierte CUE1. Die cue1∆CUE-Mutante und die Mutante cue1LL(179,180)SS, die ei-nen Defekt bei der Bindung von Ubc7 aufweist, sind sogar etwas stärker exprimiert.
Wie erwartet, ist in Membranen aus ∆cue1-Zellen kein Ubc7-Protein vorhanden.
Auch die Expression der LL(179,180)SS-Mutante führt offenbar zum Verlust der Ubc7-Rekrutierung an die Membran. Bei längerer Exposition eines Röntgenfilms auf dem Immunblot wird jedoch ein sehr schwaches Signal für membranlokalisiertes Ubc7 sichtbar (ohne Abbildung). Die Menge an membranrekrutiertem Ubc7 in diesem Stamm ist also lediglich deutlich reduziert. Expression der übrigen cue1-Mutanten beeinflussten die Lokalisierung des Ubc7 nicht, es ist in vergleichbaren Mengen im Solubilisat der Membranen vorhanden. Weitere Ligase-interagierende Proteine, Ubx2 und Cdc48 sind in allen cue1-Mutanten unverändert im Vergleich zu CUE1-WT ex-primiert und die verschiedenen Cue1-Proteine membranlokalisiert. Nur die zum Zeit-punkt des Zellaufschlusses vorhandenen Ubc6-Mengen weisen kleine Unterschiede zwischen untersuchten Stämmen auf.
Nach Immunpräzipitation des Doa10 wurden die Proben auf co-präzipitierte Proteine untersucht (rechte Hälfte der Abbildung). Alle Cue1-Varianten sind in der Lage, mit der Ligase in etwa gleicher Stärke zu interagieren. Die CUE-Domäne bzw. deren
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Veränderung spielt demzufolge bei der Wechselwirkung mit der Ubiquitinligase keine Rolle. Anders sieht die Situation für die Interaktion von Ubc7 mit Doa10 in den cue1-Mutanten aus. In Zellen mit WT-CUE1 zeigt Ubc7 eine gute Bindung an Doa10. Auch die cue1RGA-Mutante scheint diese Interaktion nicht zu stören. Im Gegensatz dazu schwächt eine Deletion der CUE-Domäne die Wechselwirkung zwischen Ubc7 und Doa10. Dies wurde aus der Analyse der in vitro Versuche nicht ersichtlich, spielte aber vielleicht bei einer Polyubiquitinierungsreaktion mit löslichen Proteinen keine große Rolle.
Abbildung 12: Einfluss der Expression von cue1-Mutanten auf die Proteinkomposition an der ER-Membran und der Doa10-Ligase. Expression der cue1-Mutanten sowie des WT-CUE1 von einem ARS/CEN-Plasmid. Immunpräzipitation von myc-epitopmarkiertem Doa10 aus Digitonin-solubilisierten Hefemembranen. Co-präzipitierte Proteine wurden durch Antigendetektion mit Hilfe proteinspezifischer Antikörper nachgewiesen.
In vivo hingegen könnte die mit der Deletion der CUE-Domäne einhergehende Ver-kürzung von Cue1 um etwa 40 Aminsäuren eine Veränderung in der in der Struktur des Ligasekomplexes hervorrufen. Eine deutliche Verringerung des Abstands von Cue1-gebundenem Ubc7 zur ER-Membran und zur Doa10-Ligase könnte zu einer Störung der E2-E3 Interaktion führen. Eine sehr transiente Wechselwirkung des E2 mit dem E3 würde ebenfalls in einer schwachen Ligasebindung des Ubc7 in der cue1∆CUE-Mutante resultieren. Es ist vorstellbar, dass aufgrund der fehlenden Stabi-lisierung der substratkonjugierten Ubiquitinkette an der Ligase, die Interaktion von Ubc7, Doa10 und dem Substrat nicht so stabil ist wie unter WT-Bedingungen.
Abwesenheit oder Reduktion von Ubc7-Mengen an der ER-Membran, wie im ∆cue1-Stamm oder der cue1LL(179,180)SS-Mutante, führt zur Stabilisierung des mit Doa10-interagierenden kurzlebigen Ubiquitin-konjugierenden Enzyms Ubc6. Dies wird auch nach Co-Präzipitation des Ubc6 mit der Ligase deutlich, da in diesen Stämmen im Vergleich zum CUE1-WT eine höhere Menge von Ubc6 mit der Ligase assoziiert ist.
Es fällt auf, dass bei Expression des endogen kodierten WT-CUE1 nahezu kein Ubc6 mehr mit der Ligase interagiert, während mit dem Plasmid-kodierten WT-CUE1 noch ein gewisser Anteil an Ubc6 mit Doa10 co-präzipitiert. Es ist möglich, dass das Cue1-Protein, welches durch Expression des Plasmid-kodierten CUE1 synthetisiert wird, aus unbekannten Gründen nicht die Funktionalität des Proteins erreicht, das durch Expression des chromosomalen CUE1 gebildet wird. Somit würde Ubc6 durch die beiden verschiedenen WT-Cue1-Proteine nicht in gleichem Maße abgebaut. Eine solche Beobachtung ist bereits früher auch für die Expression anderer Plasmid-kodierter Proteine gemacht worden. In der cue1RGA- und der cue1∆CUE-Mutante sind die Ubc6-Mengen am Ligasekomplex im Verhältnis zum WT-CUE1 erhöht, wo-bei die Wechselwirkung von Ubc6 mit der Ligase in der cue1∆CUE- Mutante stärker ist als die in der RGA-Mutante.
Die Interaktion von Ubx2 und Cdc48 mit Doa10 wird über die Aktivität des Ligase-komplexes reguliert. In Zellen, die WT-CUE1 exprimieren, interagiert deshalb relativ viel Ubx2 und Cdc48 mit der Doa10-Ligase. Andererseits wird in ∆cue1-Zellen oder in Stämmen, welche die cue1LL(179,180)SS-Mutante exprimieren, nahezu kein Cdc48 an die Ligase rekrutiert. Ebenso sind die Mengen von Cdc48 in der cue1RGA- und cue1∆CUE-Mutante im Vergleich zum Wildtyp reduziert, was auf eine verminderte Ubiquitinierungsaktivität des Ligasekomplexes hinweist.
Es wurde einmal mehr bestätigt, dass die Bindung von Ubc7 an eine definierte car-boxyterminale Region von Cue1 für dessen Rekrutierung an die ER-Membran und Integration in den Doa10-Ligasekomplex erforderlich ist. Ein Austausch zweier Leu-cinreste gegen Serin reicht aus, um die Bindung von Ubc7 an Cue1 deutlich zu redu-zieren. Dieser Aminosäureaustausch hat auch eine Stabilisierung des Ubc6 im Ligasekomplex zur Folge. Die fehlende Substratubiquitinierung am Ligasekomplex führt weiterhin zu einer Abwesenheit von Cdc48 an Doa10. Dies zeigt erneut, dass die Aktivität von Ubc6 allein an der Ligase nicht für eine Cdc48-Rekrutierung und im Folgenden nicht für den Abbau von Substratproteinen genügt. Die Deletion der Cue1-CUE-Domäne resultiert in diesem Versuch in einer verringerten Ubc7-Einbindung in
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den Doa10-Ligasekomplex, wohingegen die Menge an ligaseassoziiertem Ubc7 in der cue1RGA-Mutante der des WT-CUE1 gleicht. Trotzdem ist in dieser Mutante, wie auch in der cue1∆CUE-Mutante, Ubc6 im Vergleich zu WT-CUE1 stabilisiert und we-niger Cdc48 mit der Ligase assoziiert.
2.11 Die Deletion der CUE-Domäne führt zur Stabilisierung