Verhaltenstests

Getestet wurden alle fünf Substanzen (Cro, NhZ, WaeZ, NanZ, PaZ) in Gruppen von n

= 5 Tieren. Für die Zootoxine, die zur fMRT-Messung ausgewählt wurden (Cro/NhZ/NanZ), folgte im Anschluss an die statistische Auswertung eine Wiederholung der Messung mit drei neuen Versuchsgruppen (jeweils n = 5), um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu überprüfen (siehe 4.3, Tabelle 1).

Alle Verhaltensversuche fanden in einem speziell dafür vorgesehenen Raum statt.

Tiere, die an Verhaltenstests teilnehmen sollten, wurden bereits sieben Tage vor Beginn der Adaptationsphase in ihren Gruppenkäfigen in die für sie neue Umgebung verbracht, um ihnen eine Gewöhnung an die neuen Geräusche und Störungen zu ermöglichen (Gewöhnungsphase: 7 d).

Die Adaptationsphase erstreckte sich im Anschluss an die Gewöhnungsphase jeweils über drei Tage, an denen die Tiere immer zur selben Uhrzeit (täglich zwischen 9.00 Uhr und 13.00 Uhr) an alle Geräte gewöhnt wurden (Adaptationsphase: 3 d).

Die Messphase begann für alle Tiere am ersten Tag mit einer Kontrollmessung unter Injektion von 5 ml 0,9%-iger NaCl-Lösung. Diese Messung ergab für jedes Tier

individuelle Basiswerte, die dann mit den Werten nach Zootoxin-Injektion verglichen werden konnten. Am zweiten Tag wurden dann jeweils die Zootoxin-Messungen durchgeführt (Messphase: 2 d).

4.6.1 Hargreaves-Test

Beim Hargreaves-Test (Abb. 8) handelt es sich um einen Versuch zur Bestimmung der Schmerzwahrnehmung plantar an den Hinterpfoten der Versuchstiere (Hargreaves et al., 1988). Dafür standen fünf bodenseitig aus Gittern bestehende Einzelboxen mit den Maßen 21 cm x 17 cm x 14 cm sowie eine Infrarot-Apparatur (7370 Plantar Test, UGO BASILE Biological Research Apparatus) zur Verfügung.

Abb. 8: Ratte im Hargreaves-Test

Die Tiere wurden vor Beginn der Messung für eine Stunde aus ihren Käfigen jeweils einzeln in eine ihnen zugewiesene Gitterbox des Hargreaves-Aufbaus gesetzt, um sie an die Situation zu gewöhnen. Während der Experimente mussten die Tiere ruhig und entspannt, jedoch nicht schläfrig sein, um die Ergebnisse nicht zu verfälschen. Die Messungen wurden dann eine Stunde nach der Injektion durchgeführt. Mittels der Hargreaves-Apparatur wurde ein Infrarotstrahl von unten durch den Drahtboden der Gitterboxen auf die plantare Fläche der Pfoten appliziert. Über einen Spiegel konnte der Untersucher die Bauchseite des Tieres betrachten und den Infrarotstrahl

punktgenau mittig auf die Hinterpfote platzieren. Jede Hinterpfote wurde dann abwechselnd insgesamt viermal rechts und links stimuliert. Über eine Lichtschranke konnte die paw-withdrawal latency (PWL) bestimmt und am Gerät abgelesen werden.

4.6.2 Tail-Flick-Test

Beim Tail-Flick-Test handelt es sich um einen Versuch zur Bestimmung der Schmerzwahrnehmung ventral am Schwanz der Versuchstiere (D´Amour, 1941). Dazu wurde eine Infrarot-Tail-Flick-Apparatur (7360 (230 Volt), UGO BASILE Biological Research Apparatus) eingesetzt. Zur Fixation und Ruhigstellung der Versuchstiere kam ein selbstentworfener Rattenfixator zum Einsatz (Abb. 9). Dieser wurde aus einer Rotiprotect-Vinyl-Handschuh-Schachtel und einer blickdicht lackierten Wasserflasche hergestellt. Er diente der abgedunkelten und somit ablenkungsfreien Fixation der Versuchstiere während der Durchführung des Tail-Flick-Tests.

Abb. 9: Rattenfixator für den Tail-Flick-Test

Für den Tail-Flick-Test wurden die Tiere 1 h p.i. aus ihren Boxen genommen und mit der Schnauze vor den vorher auf dem Gerät platzierten Rattenfixator gehalten. Um der ungewohnten Situation außerhalb der Box zu entgehen, liefen die Ratten freiwillig in die ihnen angebotene abgedunkelte Röhre, um dort Schutz zu suchen. Nun wurde das Tier leicht mit zwei Fingern der linken Hand in der Röhre fixiert, um ein Zurückweichen zu verhindern. Mit der rechten Hand konnte dann der Schwanz auf der Infrarotlichtquelle der Tail-Flick-Apparatur platziert werden. Gemessen wurde an drei verschiedenen Stellen im mittleren Drittel an der Unterseite des Schwanzes. Via

Lichtschranke wurde die Zeit bis zum Wegziehen des Schwanzes gemessen und dann als sogenannte tail-withdrawal latency (TWL) protokolliert.

4.6.3 Rota-Rod-Test

Die Rota-Rod-Apparatur (Thyristor TR 50) dient zur Detektion von motorischen Störungen bei den Versuchstieren nach Applikation einer Testsubstanz (Kuribara et al., 1977). Zur Bestimmung der Zeit, die das Versuchstier in der rotierenden Apparatur verbringt, diente eine handelsübliche Stoppuhr.

Jedes Tier wurde 1 h p.i. einzeln auf eine sich mit festgelegter Geschwindigkeit (fünf Umdrehungen/min) drehende Rolle gesetzt (Abb. 10). Durch seitliche Wände konnte ein Abspringen verhindert werden. Mit einer Stoppuhr wurde die Zeit gemessen, die die Ratte in der Apparatur lief. Durch schnelles Auffangen wurde verhindert, dass die Tiere beim Herunterfallen von dem Gerät entkommen oder sich verletzen konnten.

Abb. 10: Ratte im Rota-Rod-Test

4.6.4 Open-Field-Test

Der Open-Field-Test wird verwendet, um das Explorationsverhalten und die Lokomotion der Versuchstiere in einer ungewohnten Umgebung zu beobachten (Prut und Belzung, 2003). Hierfür wurde im Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie eine passende Apparatur gebaut. Diese besteht aus

leicht zu reinigendem dunkelgrauem Hartplastikmaterial. Über einer 1 m x 1 m großen Plattform mit 40 cm hohen Wänden ermöglichte ein aus weißem Tuch bestehender Baldachin eine indirekte Beleuchtung und optische Abschirmung der Tiere (Abb. 11).

Zur Videoaufnahme kam eine Überwachungskamera der Firma CONRAD zum Einsatz (Auflösung 640 x 480 Pixel). Diese war ausgestattet mit einem SDHC (secure digital high capacity)-Slot sowie mit acht Infrarot-LEDs (light emitting diode). Die Montage der Kamera erfolgte in einer Höhe von circa 1,20 m in einer Aussparung des Baldachins, um die gesamte Plattform überwachen zu können.

Abb. 11: Aufbau für den Open-Field-Test

Jedes Tier wurde einzeln für zehn Minuten in die Versuchsanlage eingesetzt. Seine Bewegungen im Raum wurden kontinuierlich mittels der oben installierten Kamera erfasst. Um optische Störungen zu vermeiden, wurde der Stoffbaldachin verschlossen.

Alle störenden Lichtquellen, außer der diffusen Deckenbeleuchtung, wurden ausgeschaltet. Absolute Ruhe war für die Durchführung des Experiments unerlässlich.

Zwischen den Tests wurde die Plattform jeweils von Kot und Urin des Vorgänger-Tieres gesäubert, desinfiziert und kurz gelüftet, um immer dieselben

Anfangsbedingungen zu haben und eine Verhaltensbeeinflussung durch Duftspuren der Vorgänger zu verhindern.