2. Material & Methoden
2.3 In vitro Phase–II-Metabolismus von Irilon
2.3.4 Untersuchungen mit UGT-Supersomen ®
Die eingesetzten Supersomen® sind Enzympräparationen, die aus mit der DNA einzelner humaner metabolischer Enzyme transfizierten Insektenzellen hergestellt werden. Diese enthalten somit jeweils nur eine definierte Isoform der humanen UGTs. Da im Rahmen dieser Arbeit ausschließlich UGTs aus humaner DNA verwendet werden, wird auf die Bezeichnung „human“ im Weiteren verzichtet. Die Supersomen® wurden von verschiedenen Firmen bezogen und weisen unterschiedliche Enzymkonzentrationen auf (siehe Tabelle 11).
Tabelle 11: Enzymkonzentrationen und Bezugsquellen der verschiedenen Isoformen der Supersomen.
Isoform Bezugsquelle Proteingehalt mg/mL (Herstellerangaben) UGT 1A1 BD Biosciences (Heidelberg) 5,0
UGT 1A4 BD Biosciences (Heidelberg) 5,0 UGT 1A7 Invitrogen GmbH (Karlsruhe) 10,8 UGT 1A8 BD Biosciences (Heidelberg) 5,0 UGT 1A9 BD Biosciences (Heidelberg) 5,0 UGT 1A10 Invitrogen GmbH (Karlsruhe) 10,7 UGT 2B15 BD Biosciences (Heidelberg) 5,0
59 Bestimmung der UGT-Enzymaktivität
Bevor die Supersomen und die MIKs für enzymkinetische Umsetzungen verwendet werden, muss deren Aktivität festgestellt werden. Dafür werden Inkubationsversuche mit einem Substrat durchgeführt, von dem bekannt ist, dass es von den zu untersuchenden UGTs glucuronidiert wird.
Das verwendete Substrat ist 7-Hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin (7-HFC). Es wird auch als 4-(Trifluoromethyl)umbelliferon bezeichnet.
In dieser Arbeit wird im Folgenden 7-HFC als Bezeichnung für das Substrat und 7-HFC-GlucA für das Glucuronid (7-Hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin-Glucuronid; M = 338 g/mol), welches bei den Umsetzungen entsteht, verwendet.
Bei den Enzymaktivitätsbestimmungen für die UGTs werden laut Anweisungen der Firma BD Gentest verschiedene Enzymkonzentrationen für die einzelnen Enzyme eingesetzt. Für das Isoenzym UGT 1A7 wird eine mittlere Enzymkonzentration gewählt, da kein Datenblatt der Firma PANVERA verfügbar ist. Die Aktivität der MIKs wird in der Regel nicht bestimmt. MIK-Präparationen enthalten eine große Anzahl verschiedener Enzyme (Venkatakrishnan et al., 2001), eine Aktivitätsbestimmung gibt keinen Aufschluss über einzelne aktive oder nicht aktive Enzyme, sondern lediglich über eine summarische Aktivität. Da die zur Verfügung stehenden MIKs von verschiedenen Quellen bezogen und unterschiedlich lange bei -84 °C gelagert wurden, wird ihre Aktivität zur Sicherheit überprüft. Ein unspezifischer Vergleich der Aktivität in Bezug auf 7-HFC innerhalb der verschiedenen MIKs ist dann möglich (Ghosal et al., 2004a).
Verwendete Lösungen
Die Lösungen für den Inkubationsansatz sind detailliert in Kapitel 6.2.3.2 aufgeführt.
● 7-HFC, 2,5 mM gelöst in DMSO/Phosphatpuffer (pH 7,4) (v/v, 50/50)
● 7-HFC-GlucA, 4,47 mM gelöst in Methanol.
60 Durchführung
Die Aktivitätsbestimmung der Enzyme wird in einem Gesamtvolumen von 200 µL durchgeführt. Die zu pipettierenden Mengenangaben werden dem Pipettierschema (Tabelle 12) entnommen.
Tabelle 12: Pipettierschema für die Umsetzung von 7-HFC zur Aktivitätsbestimmung der eingesetzten Enzyme.
UGTs/ Enzym
Phosphat-puffer
MgCl2 (10 mM)
Alamethicin (25 µg/mL)
Lacton (5 mM)
7-HFC (50 µM)
UDPGA (4 mM)
Mikrosomen [µL] [µL] [µL] [µL] [µL] [µL] [µL]
UGT 1A1 40 56 20 50 10 4 20
UGT 1A4 10 86 20 50 10 4 20
UGT 1A7 9 87 20 50 10 4 20
UGT 1A8 10 86 20 50 10 4 20
UGT 1A9 2 94 20 50 10 4 20
UGT 1A10 13 83 20 50 10 4 20
UGT 2B15 10 86 20 50 10 4 20
RLM 1 95 20 50 10 4 20
SLM 1 95 20 50 10 4 20
HLM 1 95 20 50 10 4 20
Die Bestimmung der Enzymaktivität für das Isoenzym UGT 1A10 erfolgt laut Herstellerangabe mit 17β-Estradiol als Substrat. In Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen (Ghosal et al., 2004b; Uchaipichat et al., 2004) wird aber auch für dieses Isoenzym 7-HFC als Substrat verwendet. Da 17β-Estradiol-glucuronid als Standard zur Kalibrierung nicht zur Verfügung steht, wird in dieser Arbeit 7-HFC als Substrat für UGT 1A10 verwendet.
Für die Aktivitätsbestimmung von UGT 1A4 wird nach Ghosal et al.
(Ghosal et al., 2004b) Trifluorperazin als Substrat verwendet. Da Trifluorperazin und das zugehörige Glucuronid nicht zur Verfügung stehen, wird die Inkubation von UGT 1A4 mit 7-HFC als Referenzwert für ein nicht umsetzendes Isoenzym verwendet.
Die Inkubationsbedingungen aus Tabelle 10 (Glucuronidierungsansätze) werden für alle Enzyme und MIKs angewendet. Für den Inkubationsansatz wird 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 vorgelegt (Pipettierschema Tabelle 12).
Nach Addition von 10 mM Magnesiumchlorid, Alamethicin (25 µg/mL) und den Enzymen/MIKs in entsprechender Konzentration (Tabelle 12) wird für 10 min auf Eis inkubiert. 5 mM Saccharo-Lacton und 5 µM Substrat (7-HFC) werden zugegeben und der Ansatz für 5 min bei 37 °C
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vorinkubiert. Nach der Zugabe von 4 mM UDPGA erfolgt die Inkubation für 20 min bei 37 °C im Wasserschüttelbad. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 0,7 M Glycin-HCl-Puffer (pH 1,2) gestoppt. Nach zweimaliger Extraktion mit Ethylacetat werden die vereinigten organischen Phasen unter Stickstoffstrom zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 200 µL Methanol (80%) aufgenommen und direkt zur chromatographischen Trennung eingesetzt (Chromatographiebedingungen in Kapitel 2.3.1).
Kalibrierung mit 7-HFC-GlucA
Die Quantifizierung von 7-HFC-GlucA erfolgt anhand einer externen Kalibriergerade in einem Bereich von 0,5-100 µM. Zur Aufnahme der Kalibriergeraden werden die unterschiedlichen Verdünnungen analog den Inkubationsansätzen mit Ethylacetat extrahiert, zur Trockene gebracht und nach Aufnahme in Methanol (80%) mittels HPLC-DAD analysiert. Auf diesem Weg sollen Aufarbeitungsverluste kompensiert und Versuchsbedingungen angepasst werden. Es wird eine lineare Kalibrationsfunktion mit folgender Gleichung bestimmt:
Peakfläche = 258,3*c [nmol/40 µL] – 32,2 mit R2 = 0,993 Bestimmungsgrenze (9-faches Signal/Rausch-Verhältnis):
0,013 nmol entsprechend 3,4 ng pro Injektion
Voruntersuchung auf IRI glucuronidierende UGTs und Mikrosomen
Duch eine Voruntersuchung soll ermittelt werden, ob IRI durch Leber-MIKs der verschiedenen Spezies (Mensch, Ratte und Schwein) glucuronidiert wird und welche Glucuronide dabei gebildet werden.
Darüber hinaus werden sieben spezifische UGT-Enzyme auf ihre Fähigkeit, IRI glucuronidieren zu können, hin untersucht. Zur Verfügung stehen die UGTs 1A1, 1A7, 1A8, 1A9, 1A10 und 2B15, die eine Auswahl an jenen Enzymen darstellen, die ähnliche Substrate umzusetzen (King et al., 2000). Die Inkubationsansätze für dieses Screening werden bei zwei
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Substratkonzentrationen (2,5 µM und 25 µM) gemäß dem in Tabelle 13 angegebenen Pipettierschema durchgeführt.
Tabelle 13: Pipettierschema zum Screening der Mikrosomen und UGTs auf Metabolisierung von Irilon. Die Substratlösung von Irilon wird jeweils so angepasst, dass finale Konzentrationen von 2,5 µM und 25 µM resultieren. Zusätzlich enthalten alle Ansätze MgCl2, Alamethicin, Saccharo-Lacton und UDPGA entsprechend Tabelle 10.
UGTs/Mikrosomen
Konzentration (Protein)
Volumen (Enzymsusp.)
Volumen (Puffer)
Volumen
(Substrat) Inkubationszeit
[mg/mL] [µL] [µL] [µL] [min]
UGT1A1 0,375 15 83 2 30
UGT1A9 0,375 15 83 2 30
UGT1A10 0,375 7 91 2 15
UGT1A7 0,375 7 91 2 120
UGT1A8 0,375 15 83 2 30
UGT1A4 0,375 15 83 2 30
UGT2B15 0,375 15 83 2 30
RLM 0,250 3 95 2 90
SLM 0,140 4 94 2 60
HLM 0,288 1,5 96,5 2 60
Enzymkinetische Bestimmung von km und Vmax
Um die Kinetik einer Reaktion zu erfassen, ist es wichtig im linearen Bereich der Enzymaktivität zu arbeiten. Für die Versuchsparameter Inkubationszeit und Enzymkonzentration muss diese Linearität gegeben sein. Das heißt, bei einer Verdoppelung der Inkubationszeit muss auch der Umsatz doppelt so hoch sein. Dasselbe gilt für die Enzymkonzentration.
Für unterschiedliche Substrate und UGTs bzw. MIKs werden unterschiedliche Inkubationszeiten für den Umsatz benötigt. Alkharfy und Frye inkubierten 17β-Estradiol 60 min lang mit Human- und Rattenlebermikrosomen (Alkharfy and Frye, 2002). Fisher et al. dagegen beschreiben, dass die Glucuronidierung von 17β-Estradiol mit HLM nur bis 30 min Inkubationszeit linear ist, weil bei höhren Inkubationszeiten die UGTs denaturiert werden (Fisher et al., 2000). Hingegen zeigten Doerge et al., dass die Glucuronidierung der IF GEN und DAI mit HLM und verschiedenen UGTs über 180 min linear verläuft (Doerge et al., 2000).
Genauso variabel wird der Einsatz an Enzymkonzentrationen beschrieben.
Doerge et al. setzten für ihre Inkubationsversuche 0,25 mg/mL mikrosomales Protein ein (Doerge et al., 2000), während Alkharfy und Frye mit der doppelten Konzentration bei der Glucuronidierung von
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17β-Estradiol arbeiteten (Alkharfy and Frye, 2002). Diese unterschiedlichen Angaben zeigen, dass die Bestimmung der Inkubationsbedingungen für die Glucuronidierung von IRI nötig ist. Zur Bestimmung der kinetischen Parameter Km und Vmax einer Reaktion wird die Enzymaktivität [v] in Abhängigkeit von der Substratkonzentration [S]
gemessen. Der gewählte Arbeitsbereich wird dabei bewusst niedrig gewählt, um der Situation in vivo möglichst nahe zu kommen. Die Plasmakonzentration der IF nach Aufnahme über die normale Nahrung wird mit 1 µM beschrieben, während Gewebe IF-Konzentrationen bis über 5 µM enthalten können (Gu et al., 2005; Rüfer, 2005).
Es werden Konzentrationen des Substrats von 2,5-150 µM (bei den mikrosomalen Umsetzungen) bzw. 2,5-75 µM (bei den Inkubationen mit UGTs) gewählt, welche die physiologische Situation in vivo gerade noch umfassen, allerdings bis zu in vivo nicht erreichbaren Maximal-konzentrationen ansteigen, um ein vollständiges enzymkinetisches Profil abbilden zu können. Die weiteren Parameter entsprechen denen aus Tabelle 13 unter Anpassung der Substratkonzentration.
HPLC-DAD-Quantifizierung mittels externer Kalibrierung
Zur Quantifizierung von IRI und seinen Glucuroniden nach HPLC-Trennung wird eine externe Kalibrationsgerade erstellt. Die Detektion erfolgt bei einer Wellenlänge von 270 nm und ergibt eine lineare Kalibration mit y = 13,7x – 0,22 im Bereich von 1,2-240 ng auf der Säule entsprechend einer Bestimmungsgrenze (entsprechend einem Signal/Rausch-Verhältnis von 9) von 30 ng/mL bzw. 0,1 nmol/mL.
Die Quantifizierung der gebildeten Glucuronide kann nicht kalibriert werden, da die entsprechenden Substanzen nicht kommerziell oder synthetisch zugänglich sind. Die Bestimmung der gebildeten Stoffmenge Glucuronid wird daher unter der Annahme gleicher molarer Extinktionskoeffizienten für IF und die entsprechenden Glucuronide durchgeführt. Die Zulässigkeit dieses Vorgehens kann daraus abgeleitet werden, dass die Summe der bestimmten Flächen aus Substrat und
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Produkt gut mit der Fläche übereinstimmen, die aus dem Kontrollansatz für IRI ohne Zusatz des Cosubstrates erhalten wurden. Sofern die Glucuronide eine abweichende Absorption zeigen würden, hätte die ermittelte Flächensumme in den Umsetzungen sich im Vergleich zum Kontrollwert ändern müssen.
Die Aktivität der Enyzme wird als „Relative Reaction Progress“ (RRP) nach Formel (6) (Anhang 6.1) angegeben. Der RRP spiegelt die Stoffmenge des gebildeten Produktes relativ zur Summe von detektiertem Produkt und Edukt wider. Da IRI und seine Glucuronide ganz ähnliche molare Absorption im UV zeigen, fungiert hier die Berechnung unter Bezug auf die Flächensumme gleichermaßen zur Kompensation von Pipettier- oder Injektionsfehlern.
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