Auswertung enzymkinetischer Daten

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die MIKs mit Hilfe eines solchen Verdrängungsvorganges zu untersuchen, wird der Einfluss von Decanol auf die Wiederfindung von IRI und seinen Metaboliten bei Inkubation mit RLM analysiert. Decanol wird von Dickins et al. als eine der effektivsten Displacer-Substanzen beschriebenen.

Es werden Inkubationen mit IRI durchgeführt, die nach einer 60 minütigen Inkubation mit einer definierten Menge Decanol (2 µmol/Ansatz entsprechend einer Konzentration von 1 mM) versetzt werden. Nach der Zugabe des Displacers wird weitere 30 min im Schüttelbad inkubiert und anschließend mit Ethylacetat extrahiert und mittels HPLC-DAD analysiert.

Die gefundenen Gehalte mit und ohne Einsatz von Decanol werden verglichen. Die Vergleichswerte entstammen einer Umsetzung ohne Displacer-Zusatz, die nach 60 min abgestoppt und wie üblich extrahiert wird. Ferner wird überprüft, ob die Dauer der Einwirkung von Decanol auf den postulierten MI-Komplex einen Einfluss auf die Extrahierbarkeit von IRI und seinen Metaboliten hat. Dazu wird jeweils 15, 30, 45 und 60 min nach Displacerzugabe weiterinkubiert, dann abgestoppt und extrahiert.

Chromatographische Bedingungen

Die HPLC-DAD Analyse erfolgt entsprechend Kapitel 2.1.2.

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metabolische Inaktivierung, ausgedrückt als intrinsische Clearance (Clint), in vitro als Quotient von V_max/k_m ableiten. Der Situation in vivo wird Cl_int nur bedingt gerecht, da sowohl die Adsorption an Bestandteile des Blutes wie auch die Tatsache, dass durch den Fluss des Blutes kein statisches System vorliegt, nicht einbezogen werden (Venkatakrishnan et al., 2001).

Ebenso kann die Berechnung für Clint nicht für alle atypischen Kinetiken angewendet werden (siehe Kapitel 2.2.4.3).

2.2.4.1 Klassische Kinetik

Das klassische kinetische Modell beschreibt den Reaktionsverlauf von einem Substrat über einen Enyzm-Substratkomplex zur Umsetzung zum Produkt durch katalytische Einwirkung des Enzyms. Die Geschwindigkeit der gesamten Reaktion ergibt sich aus den drei bestimmenden Einflussgrößen a) Bildung des Komplex, b) Zerfall des Komplex in Enzym und Substrat sowie c) Umsetzung zu Produkt und Enzym. Unter der Annahme einer vollständig ablaufenden Reaktion kann die Michaelis-Menten-Gleichung (Kapitel 6.1, Formel (4)) abgeleitet werden.

Bei graphischer Auftragung von Substratkonzentration S gegen Reaktionsgeschwindigkeit v entsteht für eine enzymatische Umsetzung, die diesem kinetischen Modell entspricht, eine hyperbelförmige Kurve.

2.2.4.2 Ermittlung enzymkinetische Parameter

Die Ermittlung der enzymkinetischen Parameter kann aus der graphischen Darstellung von S gegen v durchgeführt werden, indem Vmax als maximale Geschwindigkeit und km aus der daraus folgenden Konzentration bei halbmaximaler Geschwindigkeit abliest. Gängigere Verfahren zur Ermittlung sind aber Linearisierungsverfahren, bei denen die experimentellen Daten in eine andere Darstellungsform transformiert werden. Im Zuge dieser Arbeit sind drei Verfahren von Bedeutung, die hier knapp eingeführt werden.

51 Lineweaver-Burk

Durch die doppelt reziproke Auftragung von 1/S gegen 1/v resultiert aus Umsetzungen, welche der klassischen Michaelis-Menten-Kinetik folgen eine Gerade, deren Achsenabschnitte den enzymkinetischen Parameter km

und Vmax entsprechen. Problematisch bei diesem Verfahren ist die ungleichmäßige Verteilung der Datenpunkte und damit die Stauchung zum Koordinatenursprung hin sowie die Tatsache, dass umgekehrt die Wertepaare bei geringer Substratkonzentration einen sehr großen Einfluss bekommen. Kleine Fehler bei der Bestimmung von v ergeben bei kleinen Werten für [S] eine große Abweichung in 1/v, bei großen Werten für [S]

sind diese eher zu vernachlässigen. Dies ist im vorliegenden Fall besonders problematisch, da diese Wertepaare in der Nähe der apparativ bedingten Bestimmungsgrenze liegen und somit zwangsläufig mit einer größeren Unsicherheit behaftet sind. Im Falle des Vorliegens von atypischen Kinetiken (siehe Kapitel 2.2.4.3) ergibt sich deutlich erkennbar keine Gerade zur Auswertung.

Eadie-Hofstee

Beim Auftragen von v gegen v/S erhält man bei nicht gehemmter oder induzierter Kinetik eine lineare Funktion, wobei Vmax dem Ordinaten-schnittpunkt und -km der Steigung der Geraden entspricht. Für die häufigsten atypischen Kinetiken ergeben sich in dieser Darstellungsform charakteristische Kurvenverläufe, die eine Identifikation erleichtern. Der zentrale Nachteil der Eadie-Hofstee-Linearisierung besteht in der fehlenden Variablentrennung, da v in beide Koordinaten eingeht sowie einer Verzerrung der Fehlergrenzen durch den Einfluss des reziproken Wertes der Substratkonzentration. Die Fehlergrenzen weiten sich von der Mitte des Diagramms hin zu niederen und zu hohen Substratkonzentrationen auf (Bisswanger, 2000).

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Bei der Linearisierung nach Hanes wird S/v gegen S aufgetragen, und die Werte für km und Vmax lassen sich aus dem negativen Ordinatenabschnitt sowie dem reziproken Wert der Steigung ablesen. Zwar findet auch hier keine Variablentrennung statt, da S in beide Koordinaten eingeht, im Vergleich zum Verfahren nach Eadie-Hofstee stellt die Substratkonzentration aber die wesentlich weniger fehlerbehaftete Größe dar als die errechnete Reaktionsgeschwindigkeit v. Ungenauigkeiten in einzelnen Messungen werden weiterhin entlang der S-Achse unverzerrt wiedergegeben. Eine charakteristische Indikation von atypischen Kinetiken findet in dieser Darstellung nicht statt.

2.2.4.3 Atypische Kinetiken

Wenn ein Enzym nicht den Annahmen der Michaelis-Menten-Gleichung (s.o.) gerecht wird, indem es zum Beispiel mehr als eine Substratbindungsstelle aufweist oder durch hohe Substrat- bzw.

Produktkonzentrationen gehemmt wird, kommt es zu einer deutlich abweichenden Kinetik. Für die vorliegende Fragestellung der Ermittlung eines enzymkinetischen Profils für die metabolische Umsetzung von IRI sind nur zwei mögliche atypische kinetische Modelle von größerer Bedeutung, auf die kurz eingegangen wird (Houston and Kenworthy, 2000).

(Substrat- oder Produkt-) Hemmung

Eine Hemmung tritt auf, wenn entweder die durch enzymatische Umsetzung erzeugten Produkte (Produkthemmung) oder das Substrat selbst (Substrathemmung) ab einer gewissen Schwellenkonzentration inhibitorisch auf die Enzymreaktion einwirken. In der Darstellung nach Michaelis-Menten lässt sich in diesen Fällen beobachten, dass die Geschwindigkeit ein Maximum durchläuft, bei weiter steigender Substratmenge aber wieder abfällt. Wird eine solche atypische Kinetik nicht erkannt und die Daten nach Lineweaver-Burk ausgewertet, werden

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falsche Ergebnisse für die enzymkinetischen Parameter erhalten, da Vmax

zu niedrig kalkuliert wird. Infolge dessen wird auch die Cl_int als zu gering berechnet. In Konzentrationsbereichen, die noch nicht im gehemmten Bereich liegen, oder für sehr schwach gehemmte Kinetiken ergibt jedoch eine Auswertung im Sinne einer Michaelis-Menten-Kinetik gemäß Kapitel 2.2.4.2 nahezu identische Werte, da die Parameter km und Vmax in gleicher Weise als zu gering berechnet werden. Clint als Quotient dieser Parameter bleibt folglich konstant (Houston and Kenworthy, 2000). Zur Erkennung einer gehemmten Kinetik ist die Auswertung nach Eadie-Hofstee besonders geeignet. Bei Vorliegen einer solchen Kinetik beschreibt die graphische Darstellung eine deutliche nach unten geöffnete Kurve anstelle einer Geraden (Houston and Kenworthy, 2000).

Autoaktivierung

Bei einer autoaktivierten Kinetik fungiert das Substrat selbst als eine für das Enzym aktivitätssteigernd wirkende Substanz. Dies hat einen sigmoiden Verlauf der Kurve in der Auftragung von S gegen v zur Folge.

Nach einem sehr schwachen Anstieg der Umsatzgeschwindigkeit bei niedrigen Substratkonzentrationen bewirken steigende Substrat-konzentrationen eine zusätzliche Aktivierung der Enzymaktivität. Wie schon von der Kinetik nach Michaelis-Menten bekannt, strebt auch eine autoaktivierte Kinetik einer maximalen Aktivität entgegen. Je nach Ausprägung der Autoaktivierung kann dieser kinetische Typ mehr oder weniger leicht erkannt werden. Für den Fall einer schlechten Detektier-barkeit der Umsetzung bei geringen Substanzmengen ist erneut die Darstellung nach Eadie-Hofstee hilfreich, da sie für eine sigmoide Kinetik eine typische zur y-Achse hin geöffnete Ellipse an Stelle einer Geraden beschreibt. Eine Auswertung entsprechend der Michaelis-Menten-Kinetik führt dementsprechend zu falschen Resultaten. Insbesondere ist die katalytische Effizienz Cl_int hier anders zu berechnen, da es keinen echten km-Wert gibt. Clint berechnet sich hier nach Formel (5) (Kapitel 6.1).

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2.3 In vitro Phase–II-Metabolismus von Irilon