3. Ergebnisse
3.3 In vitro Phase-II-Metabolismus von Irilon
3.3.2 Untersuchung der kinetischen Parameter k m und V max
101
102
Substratkonzentration von etwa 50 µM die Werte für G1 und G2 sehr gut durch alle drei Linearisierungen auswertbar sind (Abbildung 18). Im Diagramm der Michaelis-Menten-Auftragung von Aktivität (v) gegen Substratkonzentration (S) ist bei höheren Konzentrationen dann ein Rückgang von v für die Bildung beider Glucuronide zu erkennen, der auf eine Inhibition hinweist.
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0
5 10 15 20 25 30 35
40 Lineweaver-Burk
1/v (nmol-1 *mg*min)
1/S (1/µM) G1
G2
0,15 0,18 0,21 0,24 0,27 0,000
0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030
Eadie-Hofstee
v (nmol*mg-1 *min-1 )
v/S (L*mg-1*min-1)
G1
0,002 0,003 0,004 0,005 0,02
0,04 0,06 0,08 0,10
0,12 Eadie-Hofstee
v (nmol*mg-1 *min-1 )
v/S (L*mg-1*min-1) G2
0 10 20 30 40 50
0 100 200 300 400
500 Hanes
S/v (mg*min*L-1 )
S (µM) G1
G2
Abbildung 18: Diagramme der Bildung von Glucuronid 1 (G1) und Glucuronid 2 (G2) durch HLM in den Darstellungen nach Lineweaver-Burk, Hanes und Eadie-Hofstee im Substratkonzentrationsbereich von 5-50 µM. Zusätzlich ist die Darstellung nach Michaelis-Menten im Bereich bis 100 µM gezeigt.
103
0 25 50 75 100 125 150 0,00
0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,24
Michaelis Menten
Akt (nmol*mg-1 *min-1 )
S (µM)
G1
Die Linearisierung nach Lineweaver-Burk ist demnach nur in dem genannten Konzentrationsbereich auswertbar und ergibt folgende Geradengleichungen und kinetische Parameter (Abbildung 18):
Für G1: y = 17,15x + 3,34
Vmax = 0,30 nmol*mg-1*min-1 km = 5,1 µM
Für G2: y = 161,3x + 6,09
Vmax = 0,16 nmol*mg-1*min-1 km = 26,5 µM
Bei Anwendung des Auswerteverfahrens nach Eadie-Hofstee lassen sich für den Bereich bis zu einer Substratkonzentration von 50 µM folgende Parameter errechnen (Abbildung 18):
Für G1: y = -4,66x + 0,29
Vmax = 0,29 nmol*mg-1*min-1 km = 4,7 µM
Für G2: y = -27,3x + 0,168
Vmax = 0,17 nmol*mg-1*min-1 km = 27,3 µM
0 25 50 75 100 125 150 0,00
0,04 0,08
0,12 Michaelis Menten
Akt (nmol*mg-1 *min-1 )
S (µM)
G2
Abbildung 18: Fortsetzung
104
Abbildung 19: Eadie-Hofstee Darstellung der Bildung von G1 durch HLM im gesamten Konzentrationbereich von 5-150 µM.
Die Auswertung nach Hanes führt in diesem Bereich schließlich zu folgenden Parametern (Abbildung 18):
Für G1: y = 3,54x + 15,5
Vmax = 0,28 nmol*mg-1*min-1 km = 4,4 µM
Für G2: y = 5,96x + 162,6
Vmax = 0,17 nmol*mg-1*min-1 km = 27,3 µM
Die enzymkinetischen Daten unter strikter Anwendung dieser Linearisierungsverfahren sind für alle untersuchten Enzymsuspensionen in Tabelle 28 angegeben. Höhere Substratkonzentrationen als 50 µM weichen im Eadie-Hofstee-Diagramm deutlich von der linearen Funktion ab, da hier wieder geringer werdende Werte für v ermittelt werden. Es ergibt sich also keine Gerade, sondern eine Kurve für die G1-Bildung durch HLM (Abbildung 19), deren Form in der Literatur als Hinweis auf eine vorliegende Substratinhibition beschrieben wird (Ueng et al., 1997;
Houston and Kenworthy, 2000).
0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030
Eadie-Hofstee
gesamter Konzentrationsbereich
v/S (L*mg-1*min-1) v (nmol*mg-1 *min-1 )
G1
105
Nimmt man eine Substratinhibition für die Bildung von G1 an und verwendet die entsprechende Formel nach Gleichung (8) (Kapitel 6.1) zur Auswertung über die Michaelis-Menten-Darstellung, erhält man folgende enzymkinetische Parameter mit der Inhibitionskonstante (kS):
Vmax = 0,40 ± 0,03 nmol*mg-1*min-1 km = 8,7 ± 1,2 µM
kS= 121,7 ± 22,8 µM
Für die Bildung von G2 durch HLM lässt sich weder eine Anpassung unter der Annahme Substratinhibition noch gemäß einer Autoaktivierung sinnvoll durchführen, da in beiden Fällen die errechneten Schwankungsbreiten der Parameter sehr hoch sind (km = 131 ± 75 µM für eine Substrathemmung bzw. ein R2 von nur 0,95 für die sigmoide Anpassung). Andererseits kann aber auch keine der beiden Annahmen ganz ausgeschlossen werden.
Für die Leber-MIKs von Ratte und Schwein werden die enzymkinetischen Parameter analog bestimmt (Tabelle 29). Dabei ist für die RLM ein komplexes kinetisches Verhalten zu beobachten. Die einfache Auftragung von Substratkonzentration gegen Umsatzgeschwindigkeit ähnelt nur auf den ersten Blick dem Bild, das sich für die HLM in Abbildung 18 ergibt. Im Gegensatz zu der Kinetik der Bildung von G1, die erneut dem Verlauf einer Umsetzung mit Substrathemmung bei sehr hohen Substratmengen folgt, lässt sich zusätzlich für G2 bei niedrigen Konzentrationen ein sigmoider Kurvenverlauf erahnen (Abbildung 20). Durch die angewendeten Auswerteverfahren lassen sich zunächst in der Darstellung nach Lineweaver-Burk für die Bildung von G1 problemlos die Werte für km
(13,7 µM) und Vmax (0,54 nmol*mg-1*min-1) ablesen. Eine lineare Auswertung der Bildung von G2 ist nicht durchführbar. Die Auswertung nach Eadie-Hofstee liefert für G1 in niedrigen Konzentrationsbereich ganz ähnliche Werte wie die Lineweaver-Burk-Auswertung. Unter Einbeziehung der hohen Konzentrationen ist auch hier wie für die HLM das typische Bild
106
einer substratgehemmten Kinetik zu erkennen. Für G2 beschreibt die Darstellung nach Eadie-Hofstee eine nach links geöffnete Ellipse, die als Indikator für einen sigmoiden kinetischen Verlauf der Reaktion gilt (Abbildung 20). Dies deckt sich mit dem Kurvenverlauf von [v] gegen [S]
aus der Michaelis-Menten-Darstellung und deutet somit auf einen kinetischen Verlauf hin, der auf einer schwachen Autoaktivierung beruht.
Zusätzlich deutet der leichte Abfall der Enzymaktivität bei sehr hohen Substratkonzentrationen auf eine Substratinhibierung hin. Eine solche gemischte Kinetik ist mit der Zusammensetzung von MIKs, die verschiedene UGTs enthalten, erklärbar. Sie kann aber nicht ohne Weiteres aus der Darstellung nach Eadie-Hofstee abgelesen werden.
Tabelle 28: Ermittelte enzymkinetische Parameter Vmax [nmol*mg-1*min-1] und km [µM] der Irilonglucuronidierung durch unterschiedliche UGTs und MIKs. „n.d.“:
Glucuronid nicht detektiert; „-“: keine lineare Anpassung möglich; „LB“: Auswertung nach Lineweaver-Burk; „EH“: Auswertung nach Eadie-Hofstee.
IRI-G1-LB
IRI-G1-Hanes
IRI-G1- EH
IRI-G2-LB
IRI-G2-Hanes
IRI-G2 EH
UGT 1A1 Vmax 0,26 0,30 0,30 0,04 0,03 -
km 9,1 10,4 10,4 3,8 0,73 -
UGT 1A7 Vmax 0,03 0,02 0,02 n.d. n.d. n.d.
km 5,5 3,8 5,1 n.d. n.d. n.d.
UGT 1A8 Vmax 0,31 0,28 - 0,16 0,16 -
km 18,1 14,8 - 20,1 19,5 -
UGT 1A9 Vmax 0,25 0,26 0,25 n.d. n.d. n.d.
km 4,1 4,9 4,2 n.d. n.d. n.d.
UGT 1A10 Vmax n.d. n.d. n.d. 0,84 0,91 0,85
km n.d. n.d. n.d. 7,5 8,9 7,6
HLM Vmax 0,30 0,28 0,29 0,16 0,17 0,17
km 5,1 4,3 4,7 26,5 27,3 27,3
RLM Vmax 0,54 0,55 0,55 - - -
km 13,7 11,2 11,3 - - -
SLM Vmax 0,19 0,23 0,23 - - -
km 10,5 12,4 12,6 - - -
107
Für die Bildung von G1 durch RLM lassen sich durch Anpassung folgende kinetische Parameter einer Substratinhibition bestimmen:
Vmax = 0,89 ± 0,28 nmol*mg-1*min-1 km = 20,4 ± 10,3 µM
kS= 80,1 ± 47,7 µM
Für G2 lassen sich durch Anpassung folgende Werte eines sigmoiden Reaktionsverlaufes errechnen. „n“ gibt dabei den Grad der Sigmoidität an:
Vmax = 0,25 ± 0,01 nmol*mg-1*min-1 k = 12,6 ± 1,1 µM
n = 2,5 ± 0,5
Die Umsetzung mit SLM führt für die Bildung von G1 in niedrigen Konzentrationsbereich bis etwa 50 µM für alle Auswerteverfahren ebenso zu einer linearen Funktion mit vergleichbaren Kenndaten. Bei sehr hohen IRI-Konzentrationen ist auch hier für die Bildung von G1 in der Eadie-Hofstee-Darstellung eine Substrathemmung ablesbar. Eine dement-sprechende Auswertung führt zu einem Vmax von 0,26 nmol*mg-1*min-1, einem km von 14,1 µM sowie einer sehr hohen Hemmkonstante ks von 214,5 µM. Das durch SLM dominierend gebildete G2 zeigt auch hier eine abweichende Kinetik. Die Auswertung nach Lineweaver-Burk ist zwar rechnerisch möglich, liefert aber mit einem km von über 75 µM und
Abbildung 20: Michaelis-Menten- und Eadie-Hofstee-Darstellung für die Bildung von G2 bei Umsetzung von Irilon mit RLM dargestellt für den gesamten Konzentrations-bereich.
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25
0,30 Eadie-Hofstee
v [nmol*mg-1*min-1]
v/S [L*mg-1*min-1] 0 20 40 60 80 100 120 140 160
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
Michaelis-Menten
v [nmol*mg-1*min-1]
S [µM]
108
Vmax = 3,4 nmol*mg-1*min-1 Werte, die nicht dem Verlauf der Kurve in der Michaelis-Menten-Auftragung von S gegen v entsprechen. Der Eadie-Hofstee-Plot gibt einen zusätzlichen Hinweis auf eine atypische Kinetik, die allerdings nicht eindeutig einer Substrathemmung oder Autoaktivierung zuzuordnen ist (Abbildung 21). Eine Auswertung nach Hanes führt für G2 ebenso zu keinen eindeutigen Ergebnissen. Eine Anpassung an einen sig-moiden Kurvenverlauf (R2 = 0,958) führt zu Vmax = 1,2 nmol*mg-1*min-1 sowie k = 11,6 und n = 2,0. Mit einer fast identischen Standardabweichung der einzelnen Messpunkte von der angepassten Kurve (R2 = 0,959) ist aber auch eine Substratinhibition denkbar, die zu Vmax = 3,0 nmol*mg-1*min-1 sowie km = 48,9 und ks = 96,4 nmol*mg-1*min-1 führt. Zusammenfassend kann somit für die Bildung von G2 durch SLM kein eindeutiges kinetisches Modell vorgeschlagen werden. Tabelle 29 fasst die Auswertung der kinetischen Daten für die Leber-MIKs unter Berücksichtigung der atypischen Kinetiken zusammen.
Abbildung 21: Eadie-Hofstee-Darstellung der Bildung von G2 aus Irilon durch SLM.
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
v [nmol*mg-1 *min-1 ]
v/S [L*mg-1*min-1]
109
Tabelle 29: Ermittelte enzymkinetische Parameter Vmax [nmol*mg-1*min-1] und km
[µM] der Irilonglucuronidierung durch unterschiedliche UGTs und MIKs unter Berücksichtigung der atypischen Kinetiken. „n.d.“: Glucuronid nicht detektiert; „-“:
Modell kommt nicht in Betracht; „S50“: Substratkonzentration bei halbmaximaler Geschwindigkeit einer autoaktivierten Kinetik; „n“: Grad der Sigmoidität; „ks“:
Hemmkonstante [µM].
Enzym IRI-G1-Subinh. IRI-G1-Autoakt. IRI-G2-Subinh. IRI-G2-Autoakt.
1A1 Vmax 0,74 ± 0,27 - n.a. n.a.
km 27,7 ± 12,0 - n.a. n.a.
ks = 7,6 ± 3,4 - n.a. n.a.
1A7 Vmax 0,04 ± 0,01 - n.d. n.d.
km 9,4 ± 2,5 - n.d. n.d.
ks= 101 ± 37,9 - n.d. n.d.
1A8 Vmax 1,4 ± 0,92 - - 0,11 ± 0,01
km 107 ± 77,9 - - S50 = 10,0 ± 2,1
ks= 14,5 ± 11,3 - - n = 1,6 ± 0,6
1A9 Vmax 0,27 ± 0,03 - n.d. n.d.
km 5,0 ± 1,5 - n.d. n.d.
ks= 533 ± 590 - n.d. n.d.
1A10 Vmax n.d. n.d. 1,0 ± 0,23 0,64 ± 0,05
km n.d. n.d. 10,3 ± 4,3 S50 = 4,4 ± 0,9
n.d. n.d. ks = 121 ± 79,0 n = 1,5 ± 0,5
HLM Vmax 0,40 ± 0,03 - 0,63 ± 0,33 -
km 8,7 ± 1,2 - 131 ± 75,3 -
ks= 122 ± 23 - ks= 20,9 ± 13,2 -
RLM Vmax 0,89 ± 0,28 - - 0,25 ± 0,01
km 20,4 ± 10,3 - - S50 = 12,6 ± 1,1
ks= 80,1 ± 47,7 - - n = 2,5 ± 0,5
SLM Vmax 0,26 ± 0,04 - - 1,18 ± 0,06
km 14,1 ± 3,9 - - S50 = 11,6 ± 1,5
ks= 215 ± 97,4 - - n = 2,0 ± 0,5
110
Für die unterschiedlichen UGTs lassen sich in allen Fällen gut übereinstimmende enzymkintische Parameter über die Linearisierungen nach Lineweaver-Burk und Hanes errechnen. Damit ist in der Regel eine Auswertung im Sinne einer Kinetik nach Michaelis-Menten möglich, die zu den in Tabelle 28 dargestellten Kenndaten führt. Eine Auswertung nach Eadie-Hofstee ist nur in den Fällen durchführbar, in denen lediglich ein einziges Glucuronid gebildet wird. Generell lässt sich für alle rekombinanten UGTs bei hohen Substratkonzentrationen ein leichter Rückgang der Umsatzgeschwindigkeit erkennen, der aber weit weniger ausgeprägt ist als bei den MIKs. Da sich dieser Effekt vielfach nur bei der höchsten eingesetzten Substratkonzentration auswirkt, ist eine entsprechende Auswertung im Sinne einer atypischen Substrathemmung hier mit einer größeren Unsicherheit behaftet, die sich an den in Tabelle 29 angegebenen Schwankungsbreiten ablesen lässt. Bei den Enzymen UGT 1A1 und 1A8, die beide Produkte bilden, ist eine deutlichere atypische Kinetik abzulesen, die auch hier auf eine Substratinhibition hindeutet. Eine entsprechende Auswertung der Bildung von G1 über eine Anpassung nach der Gleichung aus Kapitel 6.1 führt bei UGT 1A1 zu Werten von km = 27,7 µM und Vmax = 0,74 nmol*mg-1*min-1 bei einer starken Hemmkonstante von ks = 7,6 µM. Die Bildung von G2 ist nicht eindeutig auswertbar. Für das UGT 1A8-Enzym lassen sich für die G1-Bildung km = 106,7 µM und Vmax = 1,4 nmol*mg-1*min-1 bei einer weniger starken Hemmkonstante von ks = 14,5 µM errechnen. Hier ist auch die G2-Bildung einer autoaktivierten Kinetik folgend auswertbar. Der Grad der Sigmoidität liegt bei n = 1,6, Vmax = 0,11 nmol*mg-1*min-1 und S50 = 10,0 µM. Für beide UGTs ist eine Bildung von G2 erst ab einer Substratkonzentration von 5-7,5 µM detektierbar.
Für die weiteren UGTs ist eine sehr unterschiedliche Intensität der Glucuronidbildung zu erkennen. Dabei werden generell unter Berücksichtigung der atypischen Kinetiken höhere Werte der enzymkinetischen Parameter ermittelt, die aber nicht so stark von den durch Linearisierung erhaltenen abweichen wie bei den MIKs.
111
Dabei zeigt UGT 1A7 eine sehr geringe maximale Umsatzgeschwindigkeit von 0,02 nmol*mg-1*min-1. UGT 1A10 stellt das andere Extrem dar, hier lässt sich mit allen angewendeten Linearisierungsverfahren eine Vmax von etwa 0,9 nmol*mg-1*min-1 ermitteln.