Untersuchung auf Nährböden mit und ohne Zusatz von Antibiotika und Kontrolle der Mutanten mit Hilfe der PCR

Mittels „pick and patch“- Technik wurden 150 Kolonien von den Saccharose 2% +ADS-Platten auf 7H10-Nährböden mit Hygromycin-Zusatz und ohne Zusatz verbracht. Zusätzlich wurden genauso mit 150 Kolonien von den 7H10 +ADS-Platten ohne Saccharose verfahren.

Die Nährböden wurden bei 37°C im Brutschrank aufbewahrt. Nach vier Wochen erfolgt die Auswertung: Von den insgesamt 300 Kolonien wuchsen 18 nur auf den 7H10- Platten, der Rest wuchs entweder nur auf den 7H10-Nährböden mit Hygromycin-Zusatz oder auf beiden.

Diese 18 Klone, die ihre Hygromycin-Resistenz nachweislich verloren hatten, wurden weiter bearbeitet. Sie wurden in Flüssigmedium kultiviert, ihre genomische DNA wurde präpariert und in der PCR getestet. Dabei konnten drei Klone detektiert werden, die die gewünschte Fragmentgröße potentieller Mutanten zeigten. Einer dieser drei Klone zeigte allerdings auch ein Wildtypgen-Signal, so dass die PCR noch einmal nur unter Verwendung der genomischen DNA dieser mit Nr. 3, 4 und Nr. 8 bezeichneten Klone wiederholt wurde.

Das Ergebnis ist in der Abb. 4.26 dargestellt. Auf den Spuren 1 und 8 ein Farbmarker aufgetragen. Die Spuren 2 und 3 zeigen Wildtyp-DNA von M. tuberculosis und M. bovis. Die Spuren 4, 5 und 6 zeigen die drei M. bovis-Klone Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 8, die bereits in der PCR zuvor als potentielle Mutanten aufgefallen sind. Auf Spur 7 wurde als Kontrolle das Plasmid pSR14 aufgetragen. Man erkennt, dass die Klone Nr. 3 und Nr. 4 lediglich eine Bande auf Höhe des Plasmides zeigen, der Klon Nr. 8 hingegen zusätzlich eine Wildtyp-Bande.

1 2 3 4 5 6 7 8

1000 bp-

500 bp-

Abb. 4.26 Überprüfung der potentiellen M. bovis-Mutanten in der PCR mit den Primern SR3 und SR4. Die Spuren 2 und 3 zeigen Wildtyp-DNA von M. tuberculosis und M. bovis. Die Spuren 4, 5 und 6 zeigen die drei M.

bovis-Klone Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 8, die bereits in der PCR zuvor als potentielle Mutanten aufgefallen sind. Auf Spur 7 wurde als Kontrolle das Plasmid pSR14 aufgetragen. Man erkennt, dass die Klone Nr. 3 und Nr. 4 lediglich eine Bande auf Höhe des Plasmides zeigen, der Klon Nr. 8 hingegen zusätzlich eine Wildtyp-Bande.

4.4.7 Überprüfung der M. bovis-Mutanten in der Southern Blot-Analyse

Für die Southern Blot-Analyse wurde die genomischen DNA der Klone mit den Restriktionsenzymen SmaI und SalI verdaut. Als Wildtyp-DNA wurde M. bovis aufgetragen.

Neben den beiden Klonen Nr. 3 und Nr. 4, die sich in der vorher durchgeführten PCR als potentielle Mutanten erwiesen haben, wurden auch Klon Nr. 8 aufgetragen. Zur Detektion wurde die „narGHJI“-Sonde verwendet. In Abb.4.27 sind die Bindungsstelle der Sonde sowie die Schnittstellen des SmaI-Enzyms noch einmal dargestellt. Durch den SmaI-Verdau ergibt sich für den Wildtyp eine Fragmentgröße von 1114 bp, für die Mutanten eine Größe von 2250 bp.

Abb. 4.27 Schnittstellen des Enzyms SmaI in narGHJI-Gencluster. Durch den SmaI-Verdau ergibt sich für den Wildtyp eine Fragmentgröße von 1114 bp, für die Mutanten eine Größe von 2250 bp.

In Abb.4.28 ist der Southern Blot nach Restriktionsverdau mit dem Enzym SmaI dargestellt:

1 2 3 4

3000 bp- 2000 bp-

1500 bp-

1000 bp-

Abb.4.28 Southern Blot der M. bovis-Mutanten nach Restriktionsverdau mit dem Enzym SmaI. Auf der Spur 1 wurde genomische DNA des Wildtyp M. bovis aufgetragen. Spur 2 und 3 zeigen die Klone Nr. 3 und Nr. 4, Spur 4 den Klon Nr. 8. Sowohl der Wildtyp als auch die beiden Klone Nr. 3 und Nr. 4 zeigen die gewünschten Fragmentgrößen. Lediglich der Klon Nr. 8 zeigt eine Bande in Wildtypgröße sowie eine Bande in Mutantengröße.

In Abb.4.29 sind die Bindungsstellen der Sonde sowie die Schnittstellen des SalI-Enzyms dargestellt:

Abb. 4.29 Schnittstellen des Enyzms SalI im narGHJI-Gencluster. Durch den Verdau mit SalI ergibt sich für den Wildtyp eine Fragmentgröße von 2055 bp, für die Mutanten hingegen eine Größe von 2626 bp.

In Abb. 4.30 ist der Southern Blot nach Restriktionsverdau mit dem Enzym SalI dargestellt:

1 2 3 4

3000 bp-

2000 bp- 1000 bp-

Abb.4.30 Southern Blot der M. bovis-Mutanten nach Restriktionsverdau mit dem Enzym SalI. Auf der Spur 1 ist der Wildtyp M. bovis dargestellt. Spur 2 und 3 zeigen die Klone Nr. 3 und Nr. 4. Spur 4 zeigt den Klon Nr. 8.

Man konnte erkennen, dass die beiden Klone Nr. 3 und Nr. 4 eine Bande zeigten, welche in ihrer Größe dem Mutanten-Fragment mit 2626 bp entspricht. M. bovis auf Spur 1 zeigt hingegen eine Bande, welche dem erwarteten Wildtyp-Fragment mit 2055 bp entspricht.

Mit dieser Southern Blot-Analyse konnte gezeigt werden, dass es sich bei den M. bovis- Klonen Nr. 3 und Nr. 4 auf genotypischer Ebene um Mutanten handelt, welche eine 736 bp große Deletion in der narG-Untereinheit des Enzyms Anaerobe Nitratreduktase tragen. Als Nächstes sollte untersucht werden, ob dies auf phänotypischer Ebene im Funktionsassay Effekte zeigt.

4.4.8 Messung der Nitratreduktase-Aktivität der M. bovis- Mutanten

Die Klone Nr. 3 und Nr. 4 sowie der Wildtyp M. bovis, der als Kontrolle diente, wurden in 7H9-Flüssigmedium und für den Funktionstest vorbereitet. Das Nitrat wurde in Form von 100 µl einer 1 M KNO3

-Lösung einzelnen Ansätzen hinzugefügt. Zu festgelegten Zeitpunkten wurden Bakterienüberstände entnommen und deren Nitritgehalt wie unter 3.2.15 beschrieben bestimmt. In Abb. 4.31 wurden die Klone Nr. 3 und Nr. 4 dem Wildtyp M. bovis gegenübergestellt:

Zeit ( d )

0 2 4 6 8 10 12

Nitritkonzentration ( µmol/l )

0 200 400 600 800 1000

M. bovis mit KNO3-Zusatz

M. bovis-Klon Nr. 3 mit KNO₃-Zusatz M. bovis-Klon Nr. 4 mit KNO₃-Zusatz

Abb. 4.31 Anaerobe Nitratreduktase-Aktivität der Klone Nr. 3 und Nr. 4 im Vergleich zum Wildtyp M. bovis

Sowohl der Klon Nr. 3 als auch der Klon Nr. 4 zeigten in vitro keine Nitritbildung, was das Ergebnis der zuvor durchgeführten Southern Blot-Analyse bestätigte. Sie konnten somit als M. bovis- Mutanten charakterisiert werden, welche eine Deletion in der narG-Untereinheit des Enzyms Anaerobe Nitratreduktase tragen und somit nicht mehr in der Lage sind, unter anaeroben Bedingungen Nitrat zu Nitrit zu reduzieren.

5. Diskussion