nirBD-Gen (7529 bps)
4.1.8 Messung der Nitritreduktase-Aktivität der nirBD-Mutanten CD1-CD4
Nachdem sich die Mutanten CD1-CD4 auf genotypischer Ebene als nirBD-Deletionsmutanten erwiesen hatten, sollte untersucht werden, wie sich eine solche Deletion auf die Phänotypie der Mutanten bezüglich einer Nitritreduktion unter anaeroben Bedingungen auswirkt, da bisher nicht bekannt ist, ob das nirBD-Gencluster in Mykobakterien für eine anaerobe Nitritreduktase kodiert.
Mit Hilfe des Nitratreduktase-Test der Firma Api BioMerieux sollte die Abnahme der Nitritkonzentration über die Zeit durch die anaerobe Nitritreduktase-Aktivität gemessen werden. Dazu wurden die 4 Mutanten CD1-4 sowie als Kontrolle der nirBD-Wildtyp M. bovis BCG bis zu einer OD600 von 1,0 kultiviert. Das Nitrit wurde in Form einer sterilen NaNO2 -Lösung in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt. Zusätzlich wurden als Negativ-Kontrolle hitzeinaktivierte Bakterien verwendet, die 30 min im Wasserbad abgekocht wurden.
Damit soll ein spontaner Zerfall des Nitrites ausgeschlossen werden. Anaerobe Bedingungen wurden mit Hilfe eines Anaerobiertopfes geschaffen. Basis des Testes ist die in Kapitel 3.2.13 beschriebene Diazotierungsreaktion.
Zeit ( d )
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Nitritkonzentration ( µmol/l )
0 200 400 600 800 1000
M. bovis BCG + NaNO2
M. bovis BCG hitzeinaktiviert + NaN02
Abb.4.9 Anaerobe Nitritreduktase-Aktivität von M. bovis BCG bei Zugabe von NaNO2.
Die Abb.4.9 zeigt die Nitritreduktase-Aktivität des Tuberkulose-Impfstammes M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen. Zu beobachten war eine stetige Abnahme der Nitritkonzentration.
Zeit ( d )
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Nitritkonzentration ( µmol/l )
0 200 400 600 800 1000
CD1 + NaNO2
CD1 hitzeinaktiviert + NaNO2
Abb.4.10 Anaerobe Nitritreduktase-Aktivität der Mutante CD1 bei Zugabe von NaNO2.
In Abb.4.10 ist die Nitritreduktase-Aktivität von CD1 dargestellt. Bei der Mutante CD1 zeigte sich, dass die Menge des Nitrites kontinuierlich über den gesamten Messzeitraum abnahm.
Zeit ( d )
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Nitritkonzentration ( µmol/l )
0 200 400 600 800 1000
CD2 + NaNO2
CD2 hitzeinaktiviert + NaNO2
Abb.4.11 Anaerobe Nitritreduktase-Aktivität der Mutante CD2 bei Zugabe von NaNO2
In Abb.4.11 wird die Nitritreduktase-Aktivität von CD2 dargestellt. Bei der Mutante CD2 nahm die Nitritkonzentation ebenfalls kontinuierlich ab.
Bei der Mutante CD3, dargestellt in Abb.4.12, erfolgt der Abfall der Nitritkonzentration etwas flacher, aber ebenfalls kontinuierlich über den gesamten Messbereich.
Zeit ( d )
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Nitritkonzentration ( µmol/l )
0 200 400 600 800 1000
CD3 + NaNO2
CD3 hitzeinaktiviert + NaNO2
Abb.4.12 Anaerobe Nitritreduktase-Aktivität der Mutante CD3 bei Zugabe von NaNO2
Schließlich konnte auch in Abb.4.13 für die Mutante CD4 eine kontinuierliche Abnahme der Nitritkonzentration gezeigt werden.
Zeit ( d )
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Nitritkonzentration ( µmol/l )
0 200 400 600 800 1000
CD4 + NaNO2
CD4 hitzeinaktiviert + NaNO2
Abb.4.13 Anaerobe Nitritreduktase-Aktivität der Mutante CD4 bei Zugabe von NaNO2
Zusammenfassend ließ sich sagen, dass alle vier Mutanten in vitro weiterhin Nitrit zu Ammonium reduzierten. Warum die zuvor erfolgreich abgeschlossenen Deletion des nirBD-Genclusters keinen erkennbaren Effekt auf die Aktivität des Enzyms im Funktionsassay zeigte, muß diskutiert werden.
4.2 Vergleich der Nitratreduktase-Aktivität von M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen
Die nun folgenden Abschnitte beschäftigten sich mit der Untersuchung der Nitratreduktion verschiedener Mykobakterienstämme. Um zunächst mehr über die Nitratreduktase-Aktivität unter anaeroben Bedingungen zu erfahren, sollten die beiden pathogenen Stämme M.
tuberculosis H37Rv und M. bovis R99 dem apathogenen Impfstamm BCG in einem Funktionstest gegenübergestellt werden. Da sich die Nitratreduktase-Mutante SR106 im Tiermodell als deutlich attenuiert gegenüber dem Wildtyp gezeigt hatte (FRITZ 2001), sollte so ein möglicher Zusammenhang zwischen der Fähigkeit zur Nitratreduktion unter anaeroben Bedingungen und der Pathogenität der Stämme untersucht werden. Gleichzeitig diente dieser Abschnitt als Vorarbeit zu den in den nächsten Teilen beschriebenen narG-Deletion in M.
tuberculosis und M. bovis. Dazu wurde M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen Nitrat in Form einer KNO3-Lösung zugeführt. Zu festgelegten Zeitpunkten wurde den einzelnen Ansätzen Proben entnommen, die mit der unter 3.2.13 beschriebenen Diazotierungsreaktion auf ihren Nitritgehalt überprüft wurden.
Zeit ( d )
M. tuberculosis mit KNO3-Zusatz M. tuberculosis ohne KNO3-Zusatz
Abb.4.14 Anaerobe Nitratreduktase-Aktivität von M. tuberculosis
Unter anaeroben Bedingungen, dargestellt in der Abb.4.14, zeigte M. tuberculosis sofort innerhalb der ersten 24 Stunden einen extrem starken Anstieg der Nitritkonzentration auf 800 µmol/l. Im Anschluss sank die Konzentration bis zum Tag 2 erst stark, um danach eine flacheren Abfall zu zeigen. Ab dem Tag 6 stellte sich eine fast gleichbleibende Konzentration ein. Ohne die Zugabe von Nitrat verblieb die Nitritkonzentration bei 0 µmol/l.
In Abb.4.15 zeigte M. bovis unter anaeroben Bedingungen einen unregelmäßigen, aber stetigen Anstieg der Nitritkonzentration, der am Tag 8 sein Maximum mit einer Nitritkonzentration von 780 µmol/l erreichte. Im Anschluß fiel die Nitritkonzentration wieder ab bis zum Ende des Messzeitraumes. Ohne Zugabe von Nitrat erfolgte auch hier kein Anstieg der Nitritkonzentration über den gesamten Zeitraum.
M. bovis mit KNO3-Zusatz M. bovis ohne KNO3-Zusatz
Abb.4.15 Anaerobe Nitratreduktase-Aktivität von M. bovis
Unter anaeroben Bedingungen zeigte M. bovis BCG (Abb. 4.16) hingegen einen kontinuierlichen, aber gemäßigten Anstieg der Nitritkonzentration, der am Ende des Meßzeitraumes bei einer Nitritkonzentration von 200 µmol/l lag. Ohne Zugabe von Nitrat blieb die Nitritkonzentration bei 0 µmol/l.
Zeit ( d )
0 2 4 6 8 10 12
Nitritkonzentration ( µmol/l )
0 200 400 600 800 1000
M. bovis BCG mit KNO3-Zusatz M. bovis BCG ohne KNO3-Zusatz
Abb.4.16 Anaerobe Nitratreduktase-Aktivität von M. bovis BCG
Insgesamt zeigte sich in diesem Funktionsassay, dass M. tuberculosis unter anaeroben Bedingungen eine starke Nitratreduktase-Aktivität exprimierte, wobei das Maximum der Nitritbildung bereits nach einem Tag erreicht wurde. Danach sank die Aktivität des Enzyms immer weiter ab. Bei M. bovis setzte die Aktivität des Enzyms erst langsam innerhalb des ersten Tages ein, um dann in Stufen bis zum Tag 8 anzusteigen. Der Impfstoff M. bovis BCG zeigte unter anaeroben Bedingungen eine Nitratreduktase-Aktivität, die sich im Vergleich zu M. tuberculosis und M. bovis am schwächsten darstellte. Sie begann sehr langsam ab Tag 1, um sich dann nur wenig zu steigern.
4.3 Gezielte Deletion des narG-Genes im M. tuberculosis-Stamm H37Rv
In einer vorangegangenen Arbeit wurde der Stamm SR106 erstellt. Dabei handelt es sich um eine Mutante des Impfstoffes M. bovis BCG, die durch eine Deletion im narG-Gen nicht mehr
in der Lage ist, unter anaeroben Bedingungen Nitrat zu Nitrit zu reduzieren (WEBER, 1999).
Diese Mutante zeigte sich im Tiermodell als deutlich attenuiert gegenüber dem Wildtyp (FRITZ, 2001). Da eine narG-Deletion noch nicht in einem pathogenen Mykobakterien-Stamm durchgeführt worden war, wurde zunächst M. tuberculosis ausgewählt, denn dieser Stamm hatte im vorangegangenen Funktionstest (siehe 4.2) die stärkste Nitratreduktase-Aktivität unter anaeroben Bedingungen gezeigt.