Transkriptionsanalysen

Zur Isolierung von pflanzlicher RNA wurde die TRIZOL-Extraktionsmethode verwendet (Chomczynski, 1993). Tief gefrorenes und fein gemörsertes Pflanzenmaterial (~ 200 mg) wurde in 1,3 mL Trizolpuf-fer (380 mL/L Phenol gesättigt mit 0,1 M CitratpufTrizolpuf-fer pH 4,3; 0,8 M Guanidinthiocyanat, 0,4 M Am-moniumthiocyanat, 33,4 mL/L 3 M Na-Acetatlösung pH 5,2; 5 % Glycerin) gelöst und für 10 Min. bei

Methoden

RT geschüttelt. Nach Zugabe von 260 µl Chloroform wurden die 2 mL Reaktionsgefäße erneut 10 Min.

bei RT geschüttelt. Nach 45 Min. Zentrifugation bei 13.000 rpm und 4 °C erfolgte die Trennung der wässrigen Phase mit den Nukleinsäuren und der unteren organischen Phase mit Proteinen und Zell-trümmern. 800 µl des Überstands wurden in ein neues 1,5 mL Reaktionsgefäß überführt und mit 300 µl 2-Propanol und 300 µl Hochsalzpuffer (1,2 M Natriumchlorid, 0,8 M tri-Na-Citrat) versetzt. Die Reaktionsgefäße wurden invertiert. Während des nächsten Zentrifugationsschritts (20-60 Min. bei 13.000 rpm und 4 °C) kam es zur Fällung der RNA. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet zwei Mal mit 300 µl 70 %igem Ethanol gewaschen (10 min, 13.000 rpm, RT). Nach dem Trocknen des Pellets für 10 Min. bei RT wurde es in 15-40 µl autoklaviertem ddH2O aufgenommen und für 10 Min.

bei 65 °C gelöst. Die Konzentration wurde mit Hilfe des Nano Drop 2000c bestimmt (2.2.1.6).

2.2.6.2 cDNA-Synthese

Für die Synthese von cDNA wurde 1 µg RNA eingesetzt. Diese wurde zunächst mit 1 µl DNase I (Fer-mentas, Deutschland, St. Leon-Roth) und 1 µl 10x DNase I Puffer für 30 Min. bei 37 °C inkubiert, um Kontaminationen der cDNA mit genomischer DNA zu verhindern. Zur Inaktivierung der DNase I wurde 1 µl 25 mM EDTA hinzugegeben und für 10 Min. bei 65 °C inkubiert. Als Startoligonukleotide für die Synthese der cDNA wurden Zufallsnonamere und oligo-dT Oligonukleotide verwendet. Die Anlage-rung an die RNA erfolgte bei 70 °C für 10 Min. Schließlich wurden 20 nmol dNTPs, 4 µl RT 5x-Reakti-onspuffer und 60 U Reverse Transcriptase H- (Fermentas, Deutschland, St. Leon-Roth) hinzugeben.

Das Volumen wurde mit ddH2O auf 20 µl aufgefüllt. Die Elongation fand für 70 Min. bei 42 °C statt, gefolgt von der Inaktivierung der Reversen Transkriptase für 10 Min. bei 70 °C. Die präparierte cDNA wurde bei -20 °C gelagert.

2.2.6.3 Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)

Die Quantifizierung der Genexpression erfolgte mit Hilfe der quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR).

Dabei war die Fluoreszenz des Farbstoffs SyberGreen ein Maß der zunehmenden Menge an DNA, da dieser Farbstoff nur in DNA-gebundener Form fluoresziert. Die Amplifizierung und Quantifzierung erfolgte im iCycler (BioRad, Hercules, CA, USA) mit Ubiquitin5 als Referenzgen. Der Reaktionsmix be-stand aus 1 µl der 1:10 verdünnten cDNA als Matrize sowie 1 µl NH4-Reaktionspuffer, 0,25 U BIOTaq DNA-Polymerase (Bioline, Deutschland, Luckenwalde), 2 mM MgCl2, 100 µM dNTPs, 0,4 µM der Oli-gonukleotide, 10 nM Fluorescein (BioRad, Hercules, CA, USA) und 100.000 fach verdünnter SYBR Green I Lösung (Cambrex, Rockland, ME, USA). Der Reaktionsmix wurde mit ddH2O auf ein Volumen von 25 µl aufgefüllt.

Das verwendete PCR-Programm wird in Tabelle 2.3 aufgeführt. Anschließend wurden die relativen Genexpression mit der 2-[CT(Zielgen)-CT(Referenzgen)] -Methode nach Schmittgen und Livak berechnet (2008).

Tabelle 2.3 Ablauf einer qRT-PCR-Reaktion

Dauer Temperatur Wiederholung

primäre Denaturierung 2 Min. 95 °C 1x

Denaturierung 20 Sek. 95 °C

Anlagerungsphase 20 Sek. 55 °C 40x

Elongation 40 Sek. 72 °C

finale Elongation

4 Min. 72 °C

1x

1 Min. 95 °C

1 Min. 55 °C

Schmelzkurve 10 Sek. 55 °C – 95 °C 81x

2.2.6.4 RNA-Sequenzanalyse

Heterozygote, segregierende Linien der coi1-t- und aos- Mutante wurden angezogen und infiziert wie in 2.2.2.3 und 2.2.5.2 beschrieben. Nachdem jede individuell geerntete Pflanze genotypisiert war, konnten 33 Wurzeln für coi1-t und WTcoi1-t und 36 Wurzeln für aos und WTaos, mock und infiziert, kombiniert werden und zur RNA-Synthese eingesetzt werden. Da das Experiment für jeden Genotyp noch zweimal wiederholt wurde, erhielt man 3 Replikate für jeden Genotyp, mock und infiziert, was insgesamt zu 24 zu analysierenden Proben führte. Um analysieren zu können, welche pilzlichen Tran-skripte in Gegenwart von Pflanzenwurzeln höher exprimiert werden als bei rein saprophytischem Pilzwachstum wurden ebenfalls drei unabhängige Replikate der pilzlichen RNA hergestellt (2.2.4.3).

RNA von allen 27 Proben wurde mit der TRIZOL-Extraktionsmethode präpariert (2.2.6.1). RNA von V. longisporum wurde anschließend mit dem RNeasy Plant Mini Kit (Quiagen, Valencia, CA, USA) an-hand der Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. RNA-Sequenzanalysen wurden mit Hilfe des Illu-mina HiSeq 2000 Instrument im Transkriptom-Labor an der Universität Göttingen ausgeführt.

Die mit dem Gerät detektierten Fluoreszenzsignale wurden mit dem Illumina-Programm BaseCaller in bcl-Dateien transformiert und mit dem Programm CASAVA (v1.8.2) in fastq-Dateien demultiple-xiert. Die Sequenzalignments mit den Referenzgenomen von Arabidopsis thaliana (TAIR10) und Ver-ticillium dahliae VdLs.17 (Broad Institute) erfolgten mit dem Programm Bowtie2 (v2.1.0). Die reads pro Gen wurden mit Hilfe von HTSeq Python Skripten und den entsprechenden gtf-Genannotations-Dateien (Arabidopsis, TAIR10; Verticillium, Broad Institut) ermittelt.

Methoden

Für die Analyse der differenziellen Genexpression wurde die grafische Benutzeroberfläche der Ro-binNA Software (Version 1.2.4; Lohse et al., 2012) verwendet. Die Normalisierung und statistische Evaluation der Werte erfolgte mit DESeq (Anders und Huber, 2010).

2.2.6.5 Quantifizierung der DNA von V. longisporum

Pilzliche Biomasse wurde durch die Bestimmung der pilzlichen DNA in infizierten Pflanzen mit qRT-PCR-Analysen quantifiziert. Dafür wurde DNA aus Petiolen oder der ganzen Rosette von infizier-ten Pflanzen isoliert (2.2.1.2). Die Amplifizierung und Quantifzierung von V. longisporum-DNA er-folgte im iCycler System (BioRad, Hercules, CA, USA). Hierzu wurden die Oligonukleotide OLG70 (5’-CAGCGAAACGCGATATGTAG-3’) und OLG71 (5’-GGCTTGTAGGGGGTTTAGA-3’) verwendet, die spezifische Sequenzen der ribosomalen RNA binden (Eynck, 2007). Der Reaktionsmix bestand aus 1x Advantage Puffer (TaKaRa, Clonetech, Japan), 200 μM jedes dNTPs, 0,3 μM der Oligonukleotide OLG70 und OLG71, 0,25 U Advantage Polymerase (TaKaRa, Clonetech, Japan), 10 nM Fluorescein (Bi-oRad, Hercules, CA, USA), 100.000x verdünnte SYBR Green I Lösung (Cambrex Bio Science Rockland Inc., Maine, USA) und 25 ng der zu analysierenden DNA. Der Reaktionsmix wurde mit ddH2O auf ein Volumen von 25 µl aufgefüllt. Für die Normalisierung verschiedener DNA Präparationen dient Actin8 (AT1G49240) als Referenzgen und wird mit den Oligonukleotiden act8fow (5’-GGTTTTCCCCAGTGTT-GTTG-3’) und act8rev (5’-CTCCATGTCATCCCAGTTGC-3’) amplifiziert. Das verwendete PCR-Programm wird in Tabelle 2.3 aufgeführt.

Tabelle 2.4 Ablauf der qRT-PCR zur Bestimmung pilzlicher DNA

Dauer Temperatur Wiederholung

primäre Denaturierung 1 Min. 95 °C 1x

Denaturierung 20 Sek. 95 °C

Anlagerungsphase 20 Sek. 60 °C 40x

Elongation 40 Sek. 68 °C

finale Elongation

4 Min. 68 °C

1 Min. 95 °C 1x

1 Min. 60 °C

Schmelzkurve 10 Sek. 60 °C – 95 °C 71x

2.2.7 Biochemische Standardmethoden