Der Einfluss von JAZ-Proteinen auf die Expression der Markergene bleibt weiterhin

Bisherige Versuche haben gezeigt, dass die neue COI1-Funktion unabhängig von JA-Ile, MYC2,3,4 und zumindest bezüglich der Phosphoglyceratmutase unabhängig von NINJA agiert. Proteine, die im klas-sischen JA-Signalweg ebenfalls downstream von COI1 agieren, sind JAZ-Repressor-Proteine. Im Ge-nom von A. thaliana sind 13 Mitglieder der JAZ-Familie kodiert (Dr. Gregg Howe, persönliche Kom-munikation). Der knock-out von einzelnen Mitgliedern der Familie führt nur zu einer leichten Hyper-sensitivität der JA-Antwort (Thines et al., 2007). Die reprimierende Funktion von JAZ-Repressoren im Rahmen der JA-Signaltransduktion wurde durch die ektopische Expression eines mutierten JAZ1-Pro-teins mit einer deletierten JAS-Domäne gezeigt (JAZ1∆3). Diese dominante Mutation stabilisiert das Protein und inhibiert die JA-Antwort. Pflanzen, die JAZ1∆3-GUS unter der Kontrolle des 35S-Promo-tors des Blumenkohlmosaikvirus exprimieren, zeigen keine JA-ausgelöste Inhibierung des Wurzel-wachstums und sind steril (Thines et al., 2007). Eine Vermehrung der Linien kann nur durch Bestäu-bung mit WT-Pollen erfolgen. Anschließend erfolgt die Analyse der Nachkommen in der F2-Genera-tion entweder ohne Genotypisierung (75 % der Nachkommen tragen das dominant-negative Trans-gen), oder nach dem Nachweis der GUS-Expression in individuellen Nachkommen.

Um zu testen, ob die JAZ-Proteine Einfluss auf die neue COI1-Funktion nehmen, wurde die Genex-pression der drei Markergene in der dominant-negativen 35S:JAZ1∆3-GUS-Linie analysiert. Aufgrund

Ergebnisse

der stabilisierten Repressorproteine in dieser Mutante, erwartet man einen coi1-ähnlichen Phänotyp und somit eine erhöhte Expression der drei Markergene.

Auch in dieser transgenen Linie erfolgten die Transkriptomanalysen zunächst in Wurzelmaterial von steril auf MS-Medium angezogener Pflanzen nach MeJA-Induktion. Doch erneut zeigte JAZ10 nach Hormonbehandlung keine gute Induktion im Wildtypen (Abbildung 3.20). Der segregierende Wildtyp (Col-0*) der heterozygoten 35S:JAZ1∆3-Linie zeigt die gleiche Transkriptmenge nach MeJA, wie der unbehandelte Kontroll-WT. Man erkennt, dass die JAZ10-Expression COI1-abhängig ist, allerdings nicht durch JAZ1∆3 beeinflusst wird.

Abbildung 3.20 Quantitative RT-PCR-Analysen in Wurzeln von Col-0, aos, coi1-16 sowie 35S:JAZ1∆3 und dem segregierenden WT nach MeJA-Behandlung

Genexpressionsanalysen in Wurzeln von 3 Wochen alten, steril auf MS-Medium angezogenen Pflanzen und zweistündiger mock- und 10 µM MeJA-Behandlung. Gezeigt sind Mittelwerte von 4 Replikaten (± SEM) mit 20 Wurzeln bzw. 40 Wurzeln (35S:JAZ1∆3-GUS) / Replikat. Die relativen Transkriptmengen wurden gegen die Expression von UBQ5 normalisiert. Die relative Transkriptmenge des mock behandelten Col-0 wurde gleich 1 gesetzt. Unterschiedliche Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede mit einem p-Wert < 0,05 an (unpaired two-tailed Student t-test). * markieren jeweils beide Genotypen, die aus einer segregierenden Pflanzenlinie hervorgegangen sind.

Aufgrund der schwachen Wirkung von MeJA auf die Expression von JAZ10 in sterilen Wurzeln, wurde im Folgenden ein System verwendet, in der die MeJA-Induktion erfolgreich verläuft und das erlaubt, Einzelpflanzen der heterozygoten Linie zu untersuchen. Hydroponische Kulturen, mit einem Fas-sungsvermögen von 12 L Medium, ermöglichen es, Einzelpflanzen zur Charakterisierung sowie mit

ausreichender Biomasse zur RNA-Präparation heranwachsen zu lassen (Abbildung 3.21 (A)). In sem System wuchsen die Pflanzen acht Wochen unter Kurztagbedingungen. Ein Blatt wurde in die-sem Zeitraum zur Genotypisierung mittels GUS-Färbung verwendet, bevor es zur Behandlung der Wurzeln mit und ohne 10 µM MeJA für zwei Stunden kam. Wurzel-RNA der Einzelpflanzen wurde für Gen- und GUS-Expressionsanalysen verwendet.

Abbildung 3.21 Quantitative RT-PCR-Analysen in Wurzeln von Col-0* und 35S:JAZ1∆3-GUS*, gewachsen in hydroponischen Kulturen nach mock- und MeJA-Behandlung

(A) Aufbau einer großen hydroponischen Kultur. (B) MUG-Assay in Wurzeln von 8 Wochen alten, in großen hydroponischen Kulturen angezogener Pflanzen von Col-0* und 35S:JAZ1∆3-GUS*-Mutanten und zweistün-diger mock- und 10 µM MeJA-Behandlung. (C) Genexpressionsanalysen in Wurzeln von 8 Wochen alten, in großen hydroponischen Kulturen angezogener Pflanzen von Col-0* und 35S:JAZ1∆3-GUS*-Mutanten und zweistündiger mock- und 10 µM MeJA-Behandlung. Gezeigt sind Mittelwerte von 5 (35S:JAZ1∆3-GUS*) bzw.

12 (Col-0*) Replikaten (± SEM) mit 1 Wurzel / Replikat. Die relativen Transkriptmengen wurden gegen die Expression von UBQ5 normalisiert. Relative Transkriptmenge des mock behandelten Col-0* wurde gleich 1 gesetzt. Unterschiedliche Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede mit einem p-Wert < 0,05 (one way ANOVA, gefolgt vom Tukey-Test). * markieren jeweils beide Genotypen, die aus einer segregierenden Pflan-zenlinie hervorgegangen sind. (Teile der Abbildung sind bereits in Abbildung 3.17 gezeigt worden.)

Analysen der GUS-Aktivität verschiedener Einzelpflanzen zeigen kaum Schwankungen innerhalb der Linie und werden nicht durch MeJA beeinflusst (Abbildung 3.21 (B)).

Unter den hier verwendeten Bedingungen zeigt JAZ10 die zuvor gezeigte 200-fache Induktion der Expression nach MeJA-Behandlung in Wurzeln von Col-0 (Abbildung 3.21; vgl. Abbildung 3.17).

Ergebnisse

MeJA-induzierte Expression von JAZ10 kann allerdings ebenfalls in transgenen 35S:JAZ1∆3-GUS-Li-nien beobachtet werden, und wird nur in geringem Maße durch JAZ1∆3-GUS gestört. Offensichtlich reicht der dominant-negative Effekt des JAZ1∆3-GUS-Proteins nicht aus, um genügend JAZ-Proteine zu stabilisieren, die mit der Induktion von JAZ10 interferieren könnten, obwohl das Wurzelwachstum deutlich weniger durch JA gehemmt werden kann (Abbildung 3.23).

Die Expression der Phosphoglyceratmutase, des Germin 2 und der CRK15 wird nach MeJA-Behand-lung um den Faktor 2 - 3 in Wurzeln des Col-0 reprimiert. Auch die Expression von ICS1 folgt diesem Muster. Im Gegensatz zur 200-fachen Induktion von JAZ10 ist der reprimierende Einfluss von MeJA als schwach einzustufen. Die Expression dieser Gene ist in der 35S:JAZ1∆3-GUS-Linie tendentiell ebenfalls reduziert, d.h. stabilisierte JAZ-Proteine reprimieren das Gen in geringem Maße. Dieser Ef-fekt ist konträr zu der Wirkung von coi1, in der ebenfalls stabilisierte JAZ-Proteine vorliegen sollten, so dass JA keine Wirkung mehr haben kann. Nach Behandlung mit MeJA erfolgt keine signifikant ver-änderte Genexpression. Es scheint, als ob die stabilisierten JAZ-Proteine den leicht reprimierenden Effekt von JA auf die Markergene verhindern würden.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Expression der drei Markergene in der 35S:JAZ1∆3-GUS-Pflanze nicht erhöht ist, was bedeuten würde, dass die erhöhte Expression in der coi1-Pflanze nicht darauf zurückzuführen ist, dass JAZ-Proteine akkumulieren. Allerdings kann die Unabhängigkeit der neuen COI1-Funktion von JAZ-Proteinen aufgrund der ebenfalls schwachen Wir-kung des JAZ1∆3-GUS-Konstrukts auf die JAZ10-Expression nicht geklärt werden.

3.4 Expressionsanalysen der drei Markergene in Abhängigkeit von stabilisierten