2.1.1 Oligonukleotide
Tabelle 2.1 Auflistung der verwendeten Oligonukleotide
Die Oligobukleotide wurden von den Firmen Microsynth (Lindau, Deutschland) und Lifetechnologie (Darm-stadt, Deutschland) synthetisiert. qRT-PCR Oligonukleotide wurden bei Qiagen als QuantiTec-Primer-assaysTM bestellt. Grossbuchstaben geben die Gatewaysequenz an, in rot markierte Basen entsprechen der TIR1 Sequenz (AT3G62980)
Bezeichnung Gen Sequenz
Oligonukleotide für qRT-PCR
AT3G30750 CYP71A12 QuantiTec
AT2G38870 Protease inhibitor QuantiTec
AT1G02930 GST1 QuantiTec
AT5G37970 SAM-Methyltransferase QuantiTec
AT4G21490 NDB3 QuantiTec
AT1G74710 ICS1 QuantiTec
AT5G39190 GLP2A QuantiTec
AT2G14080 Disease resistance protein QuantiTec
AT2G29220 LERCK 31 QuantiTec
AT3G60420 Phosphoglycerate mutase QuantiTec
AT4G23230 CRK15 QuantiTec
AT5G13220 JAZ10 QuantiTec
AT1G26390_5 FAD-binding Bereberine family protein aaagctaagagtgatcctgaga AT1G26390_3 FAD-binding Bereberine family protein gtaaaatttagagcatacaatcc
PLA2A_5 AT2G26560 aagaaaagaagatccgagac
PLA2A_3 AT2G26560 attcaaacgtacaagtgacc
Egfp Qtect-R GFP gaactccagcaggaccatgtg
Egfp Qtect-F GFP accactaccagcagaacaccc
Act8fwd Actin 8 ggttttccccagtgttgttg
act8rev Actin 8 ctccatgtcatcccagttgc
Olg70 cagcgaaacgcgatatgtag
Material
Olg71 ggcttgtagggggtttaga
UBQ5fwd Ubiquitin gacgcttcatctcgtcc
UBQ5rev Ubiquitin gtaaacgtaggtgagtcca
Oligonukleotide zur Klonierung
coi185fw ctcactttgctgactttaatctgatccctgagaactgg
coi185rev gatcagattaaagtcagcaaagtgaggcttgcctttaagcttgagc coi198Dfw ccctgagaactggggagattatgttactccttggg
coi198Drev cccaaggagtaacataatctccccagttctcaggg
coi1382fw agctagaatcggttctctacttctgctcagatataactaacgaatctcttgaaag coi382rev ctgagcagaagtagagaaccgattctagctcctggcagccctgag
coi441fw neu! cgatctctctctatctggcctcttaaccgacttgggcttaagctac coi441rev neu! gttaagaggccagatagagagagatcgtctgagtttcttgcatccaatc coi466fw neu! cgtgagaatgctctcagtggcatttgcaggtgaatcagatgaaggtttaatg coi466rev neu! tgcaaatgccactgagagcattctcacgtttggactgtactgtccgatgtag GBTterm-primer atcataaatcataagaaattcgcccg
pBD2modi (fw) catcatcatcggaagagagtagtaac
JAZ1d3-GUS + attB for GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCatgtcgagttctatggaatgtt-ctgagtt
JAZ1d3-GUS + attB rev GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCtcattgtttgcc-tccctgctgcg attB1 + GUS for GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCatggtccgtc-ctgtagaaacc attB2 + GUS rev GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCattgtttgcc-tccctgctgcg ASK2-attb for GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCatgtcgacggtgagaaaaatca AKS2-attb rev GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCattcaaacgc-ccactgat Oligonukleotide zur Genotypisierung
ecoi-LP tggaccatataaattcatgcagtc
ecoi-RP ctgcagtgtgtaacgatgctc
LBb1.3 attttgccgatttcggaac
LBb1 gcgtggaccgcttgctgcaact
Oligonukleotide Zur Sequenzierung
pDONR201 gateway™ Entry-Vektor zur Klonierung von PCR-Fragmenten, KmR
Invitrogen pDONR201 + COI1 Entry-Vektor Derivat, beinhaltet die cDNA von COI1
(AT2G39940)
diese Arbeit
pDONR201 + COI1-85 Entry-Vektor Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-85
diese Arbeit
pDONR201 + COI1-98 Entry-Vektor Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-98
diese Arbeit
pDONR201 + COI1-382 Entry-Vektor Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-382
diese Arbeit
pDONR201 + COI1-441 Entry-Vektor Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-441
diese Arbeit
pDONR201 + COI1-466 Entry-Vektor Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-466
diese Arbeit
pB2GW7-HA Gateway™ Expressionsvektor für Pflanzentrans- formation, beinhaltet den CaMV 35S-Promotor, ein 3× HA-tag (N-terminal), und ein BASTA-Resistenz-gen als Selektionsmarker, SpR
Corinna Thurow
pB2GW7-HA + COI1 pB2GW7-HA Derivat, beinhaltet die cDNA von COI1 (AT2G39940)
diese Arbeit pB2GW7-HA + COI1-85 pB2GW7-HA Derivat, beinhaltet die cDNA des
mutierten COI1-85
diese Arbeit
Material
pB2GW7-HA + COI1-98 pB2GW7-HA Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-98
diese Arbeit
pB2GW7-HA + COI1-382 pB2GW7-HA Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-382
diese Arbeit
pB2GW7-HA + COI1-441 pB2GW7-HA Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-441
diese Arbeit
pB2GW7-HA + COI1-466 pB2GW7-HA Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-466
diese Arbeit
pDEST-GAD GatewayTM Expressionsvektor für Hefetrans- formation, beeinhaltet den ADH-Promotor ein Leucinsynthesegen als Selektionsmarker, AmpR.
Der Vektor ist designed um Fusionsproteine inklu-sive N-terminaler Gal4-Aktivierungsdomaine und HA tag zu erstellen.
Invitrogen
pDEST-GAD + JAZ9 pDEST-GAD Derivat, beinhaltet die cDNA von JAZ9 (AT1G70700)
pDEST-GAD + ASK2 pDEST-GAD Derivat, beinhaltet die cDNA von ASK2 (AT5G08590)
diese Arbeit
pDEST-GBKT7 GatewayTM Expressionsvektor für Hefetrans- formation, beeinhaltet den ADH-Promotor ein Tryptophansynthesegen als Selektionsmarker, KanR. Der Vektor ist designed um Fusionsproteine inklusive N-terminaler Gal4- Bindedomaine und myc tag zu erstellen.
Invitrogen
pDEST-GBKT7 + COI1 pDEST-GBKT7 Derivat, beinhaltet die cDNA von COI1 (AT2G39940)
diese Arbeit
pDEST-GBKT7 + COI1-85 pDEST-GBKT7 Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-85
diese Arbeit
pDEST-GBKT7 + COI1-98 pDEST-GBKT7 Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-98
diese Arbeit
pDEST-GBKT7 + COI1-382 pDEST-GBKT7 Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-382
diese Arbeit
pDEST-GBKT7 + COI1-441 pDEST-GBKT7 Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-441
diese Arbeit
pDEST-GBKT7 + COI1-466 pDEST-GBKT7 Derivat, beinhaltet die cDNA des mutierten COI1-466
diese Arbeit
pE-HA Gateway™ Expressionsvektor, beinhaltet den 35S-Promotor, ein 3× HA-tag (N-terminal), AmpR
Iven, 2009
PYK-TOPO Promotor von PYK10 wurde in pCR2.1-TOPO (Invitrogen) kloniert KanR, AmpR
Thomas Schmülling
PYK10GW7-HA Erstellter Gateway™ Expressionsvektor für
pDONR201 + GUS Entry-Vektor Derivat, beinhaltet die cDNA von GUS Jennifer Huhn, BSc-Arbeit pDONR201 + JAZ1∆3 Entry-Vektor Derivat, beinhaltet die cDNA von
JAZ1∆3
Sandra Balnojan, BSc-Arbeit PYK10GW7-HA + GUS PYK10GW7-HA Derivat, beinhaltet die cDNA von
GUS
Sandra Balnojan, BSc-Arbeit PYK10GW7-HA + JAZ1∆3 PYK10GW7-HA Derivat, beinhaltet die cDNA von
JAZ1∆3
PMP90RK rifr, gmr Koncz und Schell, 1986
Escherichia coli DH5α F-, gyrA 96 (Nalr), recA1, endA1, thi-1, hsdR17 (rk-mk+), glnV44, deoR, D
eGFP-Reporterstamm von V.l. 43 Eynck, 2007 Verticillium longisporum 43 isoliert in Mecklenburg /
Deutschland
Zeise und Tiedemann, 2002
Hefe Eigenschaft Referenz
PJ69-4A MATα, trp1-901, leu2-3,112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, GAL2-ADE2, LYS2 ::GAL1-HIS3, met2::GAL7-lacZ
James et al., 1996
Pflanzen Eigenschaft Referenz
Columbia, Col-0 Wildtyp NASC stock
Nr. N1902
Material
WTcoi1-t aus heterozygoter coi1-t Mutante
herausgekreuzter Wildtyp
Mosblech et al., 2011
aos JA-Biosynthesemutante SALK 017756, Alonso et
al., 2003 coi1-t T-DNA Insertionslinie innerhalb COI1
(AT2G39940)
Mosblech et al., 2011
coi1-16 JA-insensitiv, singel Nukleotid- austausch (L245F)
Ellis und Turner, 2002
coi1-1 Knock-out-Linie, durch singel
Nukleotidaustausch kommt es zum STOP-Codon (W467STOP)
Feys et al., 1994, Xie et al., 1998
coi1-5 singel Nukleotidaustausch (D98G) Yan et al., 2009
sid2-2 SA Biosynthesemutante,
myc2,3,4 Knock-out-Linie der Transkriptions-faktoren MYC2,3,4
Fernández-Calvo et al., 2011
ninja Knock-out-Linie,durch singel
Nukleotidaustausch kommt es zum STOP-Codon (P224STOP)
Ted Farmer
coi1-1 x ninja Knock-out-Linien beider Proteine Ted Farmer
PYK10:GUS Leervektorkontrolle,
Col-0 Hintergrund
Jennifer Huhn, BSc-Arbeit PYK10:JAZ1∆3-GUS exprimiert JAZ1∆3-GUS unter dem
wurzelspezifischen Promotor PYK10, COI1-85 unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotor, N-terminal 3x HA-tag
diese Arbeit
35S:HA-COI1-98 Überexpressionslinie, exprimiert COI1-98 unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotor, N-terminal 3x HA-tag
diese Arbeit
35S:HA-COI1-382 Überexpressionslinie, exprimiert COI1-382 unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotor, N-terminal 3x HA-tag
diese Arbeit
35S:HA-COI1-441 Überexpressionslinie, exprimiert COI1-441 unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotor, N-terminal 3x HA-tag
diese Arbeit
35S:HA-COI1-466 Überexpressionslinie, exprimiert COI1-466 unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotor, N-terminal 3x HA-tag
Bibdo III: 3 M Kaliumacetat, 11,5 % Essigsäure, pH 5,2
AspA (50X): 3,5 M Natriumnitrat, 350 mM Kaliumchlorid, 550 mM KH2PO4, pH 5,5
2.1.5 Nährmedien
dYT: 20 g/L Trypton, 10 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl LB-Medium: 10 g/l Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl
Hydroponisches Medium: 72 μM Fe-EDTA, 50 μM KCl, 50 μM H3BO3, 10 μM MnSO4, 2 μM ZnSO4, 1,5 μM CuSO4, 0,1 mM NaSiO3, 0,5 mM KH2PO4, 0,075 nM Na2MoO4; 1,25 mM KNO3, 0,75 mM MgSO4, 1,5 mM Ca(NO)3, die Lösung wurde aus 1000-fach konzentrierten Stammlösungen angesetzt, es wurde Leitungswasser verwendet, auf Autoklavieren wurde verzichtet
MS-Medium: 4,4 g/L MS-Medium, 20 g/L Saccharose, pH 5,7 mit KOH, 6,8 g/L Agar
½ MS-Medium: 2,2 g/L MS-Medium, 0,5 g/L MES, 10 g/L Saccharose, pH 5,7 mit KOH, 15 g/L Agar
¼ MS-Medium: 1,5 g/L MS-Medium, 0,5 g/L MES, 10 g/L Saccharose, pH 5,8 mit KOH, 4,8 g/L Agar MSS-Medium: 4,4 g/L MS-Medium, 0,5 g/L MES, 5 g/L Saccharose, pH 5,7 mit KOH
SXM-Medium: 4 g/L Casein, 2 g/L Pektin (Citrus), 2 mL/L 1 M Magnesiumsulfat, 1 mL/L 1000x Spu-renelementlösung, 20 mL/L AspA (50x), 2 % Agar
SD-Medium: 6,7 g/L Yeast Nitrogen Base, 20 g/L Glucose, 0,62 g/L SD-Leu, -Trp, -Ura + 20 mg/L Uracil, pH 5,6 mit NaOH, 12 g/L Agar
Material
SD-HALT: 6,7 g/L Yeast Nitrogen Base, 20 g/L Glucose, 0,61 g/L SD-Leu, -Ade, -His, -Trp pH 5,6 mit NaOH, 12 g/L Agar
YPAD: 10 g/L Hefeextrakt, 20 g/L Pepton, 20 g/L Glucose, 100 mg/L Adeninhemisulfat,pH 6 mit HCl, 14 g/L Agar
YEB: 10 g/L Fleischextrakt, 2 g/L Hefeextrakt, 5 g/L Pepton, 5 g/L Saccharose, pH 7,0 mit NaOH, nach dem Autoklavieren auf 2 mM MgSO4einstellen
2.1.6 Zusätze
Zusatz Konzentration Hersteller
Ampicillin 100 mg/L AGS
Cefotaxim 500 mg/L Duchefa
Coronatin 30 µM Sigma-Aldrich
Gentamycin 25 mg/L Duchefa
Kanamycin 50 mg/L Sigma-Aldrich
MeJA 50 µM bzw 10 µM Sigma-Aldrich
Spectinomycin 100 mg/L Duchefa
Rifampicin 50 mg/L Duchefa
2.1.7 Kits
Kit Hersteller
Advantage® 2 Polymerase Mix Clonetech
BioTaq DNA Polymerase Kit Bioline
DNeasy Plant Mini Kit (20) Qiagen
Ionic Detergent Compatibility Reagent ThermoScientific iProof High-Fidelity PCR Kit BioRad
LuminataForte Western HRP Substrate Merck Millipore
NucleoBond PC500 Macherey-Nagel
NucloeSpin Gel und PCR Clean-up Macherey-Nagel
NucleoSpin Plasmid Macherey-Nagel
Pierce 660 nm Proein Assay Kit ThermoScientific
RNeasy Plant Mini Kit (50) Qiagen
SuperSignal West Femto ThermoScientific
2.1.8 Enzyme
Enzym Hersteller
Advantage DNA Polymerase Clonetech
Clonase Mix (BP,LR) Invitrogen
DNaseI ThermoScientific
iProof high fidelity DNA polymerase BioRad
Restriktionsenzyme MBI Fermentas, New England Biolabs
Reverse Transkriptase H- MBI Fermentas
RNase A Qiagen
T4 DNA-Ligase MBI Fermentas
2.1.9 Grössenstandards
Grössenstandard Hersteller
GeneRuler DNA Ladder Mix MBI Fermentas Prestained Protein Ladder Plus MBI Fermentas
2.1.10 Antikörper
Antikörper Eigenschaft Hersteller
αHA-Tag Polyklonal aus Kaninchen abcam
αMYC-Tag aus Maus Cell Signaling Technology
αKaninchen aus Esel GE Healthcare
αMaus aus Schaf GE Healthcare
Material
2.1.11 Hersteller von Chemikalien und Reagenzien
AppliChem, Darmstadt, Deutschland: Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), oNPG (o-Nitro- phenyl-ß-Dgalactopyranosid)
BioRad, München, Deutschland: Fluorescein,
Biometra, Göttingen, Deutschland: Ammoniumpersulfat (APS)
Biosynth, Itasca, USA: X-Gluc ((5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Glucuronsäure) Cambrex, Rockland, USA: SYBR Green I
Carl-Roth, Karlsruhe, Deutschland: Agarose, β-Mercaptoethanol, 30 % Acrylamid:N,N´-Meth-ylenbisacrylamid (37,5:1), Bakterienagar, Bradford-Reagenz, Bromphenolblau, Ethidiumbromid, Harnstoff, NaCl, Natriumhypochloridlösung, Polyethylenglykol, Saccharose, β-Mercaptoethanol, Tet-ramethylethylendiamin (TEMED), Tris, Tween20
Duchefa, Haarlem, Niederlande: Murashige und Skoog Medium
Life Technologies, Darmstadt, Deutschland: SD-Medium, Select Hefeextrakt, Select Agar Thermo Scientific, Waltham, USA: Trypton, Casein
Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg, Deutschland: MES
Sigma-Aldrich, Stenheim, Deutschland: Orange G, Phenol, PDB-Medium
2.1.12 Hersteller von Verbrauchsmaterialien
Blotpapier (Whatman®), Deckgläser und Objektträger (Carl-Roth, Karlsruhe, Deutschland), Einweg Plastikmaterial (Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland; Eppendorf, Hamburg, Deutschland; Grei-ner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland; Carl-Roth, Karlsruhe, Deutschland; Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland), Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland), Parafilm (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland), PVDF-Membran (Merck Millipore, Darmstadt, Deutsch-land), Nucleo Bond Filter (Macherey-Nagel, Düren, DeutschDeutsch-land), Glasperlen (425-600 µM;
Sigma-Aldrich, Stenheim, Deutschland), Aqua-Deco Bodengrund (Vitakraft, Nr.12262), Ton-Granulat (Seramis)
2.1.13 Laborzubehör
3D Schüttler: Vibrax VXR basic, Magnetrührer: RH basic 2 (IKA), Agarose Gelsystem, PA-Gelsystem, Western-Blot Halbtrockenkammer (Universität Göttingen), Analysewaage: Extend, Wasserentsalzer:
Arium pro ID (Sartorius), Autoklav: VX-95 bzw. VX-150 (Systec), CCD Kamera: ChemoCam,
Geldoku-mentationssystem: Gel Imager (PA-Gele) (Intas), Eismaschine (Ziegra), Elektroporator: Gene Pulser® II, Elektroporationsküvetten, PCR-Gerät: MyCycler, qRT-PCR-Gerät: iCyclert (BioRad),
Elekt-rophoresestromgeber: EV243 bzw. EV231 (Consort), Feinwaage: 572 (Kern), Geldokumentationssys-tem (Agarosegele): Transilluminator (Biostep), Heizblock: MHR 11 bzw. TH 26 (HLC Biotech), Inkuba-tor (Memmert), konfokales Lasermikroskop: SP5-DM6000, Fluoreszenz-Stereomikroskop: Leica M165 FC (Leica), Kühlzentrifuge: Heraeus Fresco 17, Mikrozentrifuge: Pico17, RNA-/DNA-Messgerät:
NanoDrop2000, Sterilbank: Heraguard bzw. SAFE 2020, Tischzentrifuge: Heraeus Pico 117 (Thermo-Scientific), Kühlzentrifuge: Rotina 38R (Hettich), Kühlzentrifuge: RC6+ (Sorvall), Mikrotiterplatten- leser: SynergyHT (BioTek), Planzenanzuchtskammer (JohnssonControls), Pflanzenanzuchtsschrank:
AR-66L/3 (CLF Plant Climatics), pH-Meter: pH211 (Hanna Instruments), Photometer: Libera S11 (Bio-chrom), Vakuumpumpe: MD 1C (Vacuubrand), Vortexer: Vortex Genie 2 (Scientific Industries), Was-serbad: 1092 (GFL), Thoma-Zählkammer
2.1.14 Software
Software Hersteller
BioRad iQ5 BioRad, München, Deutschland BlattFlaeche Datinf GmbH, Tübingen, Deutschland
GraphPad Prism 5.00 http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ Schneider et al., 2012
LAS AF (v.2.6.7266.0) Leica Application Suite (Leica GmbH, Wetzlar, Deutschland) LAS V3.6 Leica Application Suite (Leica GmbH, Wetzlar, Deutschland)
MEGA 4 Tamura et al., 2007
Serial Cloner 2.6.1 http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html