Mutierte COI1-Proteine können die in coi1-16 erhöhte Expression von JA-Ile

Bisher konnte gezeigt werden, dass alle fünf mutierten COI1-Proteine, COI1-85, COI1-98, COI1-382, COI1-441 und COI1-466 in Hefe mit ASK2 interagieren, jedoch keinen JA-Ile induzierbaren Komplex mit JAZ9 bilden. Bezüglich der bekannten JA-abhängigen Prozesse (Fertilität, JA-Sensitivität des Wur-zelwachstums, JA-Induktion der JAZ10-Expression), verhielten sich die mit den mutierten COI1-Kon-strukten transformierten Pflanzen wie Leervektorkontrollen, d.h. sie komplementieren den coi1-16-Phänotyp nicht oder nur sehr schwach. Im Folgenden wurde getestet, ob die in coi1-16 er-höhte Expression der für die JA-Ile-unabhängige Antwort typischer Markergene (Phosphogly-ceratmutase, Germin 2 und CRK15), durch die transgenen COI1-Derivate wieder unterdrückt werden können.

Dafür wuchsen die verschiedenen transgenen Linien für drei Wochen auf MS-Medium und wurden nach dem Transfer auf 1 %ige Wasser-Agarose mock-infiziert. Erhöhte mRNA-Mengen konnte ten-denziell für alle drei Markergene in der coi1-16-Mutante gegenüber der entsprechenden WT-Pflanze in Wurzeln entdeckt werden, ein Effekt der sehr effizient durch das Wildtyp-COI1-Protein komple-mentiert werden kann (Abbildung 3.30). Unerwartet dagegen war, dass die mit dem Leervektor transformierten coi1-16-Pflanzen sich nicht identisch zu den coi1-16-Pflanzen verhielten. In diesen Pflanzen ist die Expression der Markergene reduziert. Diese partielle Komplementation des coi1-16-Phänotyps durch das Transformationsereignis war bereits bei der Quantifizierung der JA-Sen-sitivität des Wurzelwachstums aufgefallen (Abbildung 3.29 (B)). Allerdings zeigt 35S:HA-COI1-98 eine hohe Expression der Markergene. Dieses Protein scheint die Restaktivität des temperatursensitiven COI1-Proteins zu unterdrücken. Im Gegensatz dazu können die Proteine COI1-382, COI1-441 und

Ergebnisse

COI1-466 die Expression der drei Markergene unter den Wert drücken, der in diesem Experiment in der coi1-16 zu beobachten war und verhalten sich somit ähnlich wie das WT-COI1-Protein (Abbildung 3.30).

Abbildung 3.30 Quantitative RT-PCR-Analysen in mock-infizierten Wurzeln von COI1-Mutanten

Genexpressionsanalysen in Wurzeln von 3 Wochen alten, steril auf MS-Medium angezogenen Pflanzen 4 Tage nach mock-Infektion. Gezeigt sind Mittelwerte von 4 unabhängigen Replikaten (± SEM) mit 20 Wur-zeln / Replikat. Die relativen Transkriptmengen wurden gegen die Expression von UBQ5 normalisiert. Die relative Transkriptmenge von Col-gl1 wurde gleich 1 gesetzt. Unterschiedliche Buchstaben zeigen signifi-kante Unterschiede mit einem p-Wert < 0,05 an (one way ANOVA, gefolgt vom Tukey-Test).

Bei der Wiederholung des Experimentes, bei der die 35S:HA-COI1-85-Linie ebenfalls einbezogen wurde, ist die gleiche Tendenz zu beobachten: das WT-COI1 und die Proteine COI1-85, COI1-382, COI1-441 und COI1-466 unterdrücken die coi1-16 erhöhte Expression des Phosphogly-ceratmutase-Gens, wobei mit Leervektoren transformierte Linien ebenfalls nicht so eine hohe Ex-pression zeigen wie die coi1-16-Mutante (Abbildung 3.31). CRK15 zeigt ähnliche ExEx-pression wie die Phosphoglyceratmutase in den untersuchten Genotypen, jedoch tendenziell erhöhte Transkriptmen-gen in den beiden Leervektorkontrollen, ähnlich wie in der coi1-16-Mutante. Das COI1-98-Protein ist in beiden Fällen nicht funktional. Bezüglich der Expression des Germin 2 jedoch verhalten sich die Kontrollen wie erwartet und zeigen signifikant erhöhte Expression, genau wie in der coi1-16-Mutante (Abbildung 3.31). Hier können die Proteine COI1-441 und COI1-466 tendenziell und COI1-382 signi-fikant so gut wie das WT-COI1-Protein komplementieren, COI1-85 hingegen nicht.

Abbildung 3.31 Quantitative RT-PCR-Analysen in mock-infizierten Wurzeln von COI1-Mutanten

Genexpressionsanalysen in Wurzeln von 3 Wochen alten, steril auf MS-Medium angezogenen Pflanzen 4 Tage nach mock-Infektion. Gezeigt sind Mittelwerte von 4 unabhängigen Replikaten (± SEM) mit 20 Wur-zeln / Replikat. Die relativen Transkriptmengen wurden gegen die Expression von UBQ5 normalisiert. Die relative Transkriptmenge von Col-gl1 wurde gleich 1 gesetzt. Unterschiedliche Buchstaben zeigen

signifi-kante Unterschiede mit einem p-Wert < 0,05 an (one way ANOVA, gefolgt vom Tukey-Test). Bei 35S:HA-COI1-85 handelt es sich um eine heterozygote Linie.

In einem weiteren Experiment wurde die Expression der Phosphoglyceratmutase noch einmal spezi-fisch in Pflanzen, die mit dem Leervektor transformiert worden waren, und Pflanzen, die verschie-dene mutierte COI1-Konstrukte exprimieren, verglichen (Abbildung 3.32). In einem Versuch mit meh-reren internen Kontrollen wuchsen jeweils 10 Pflanzen einer Referenzlinie (35S:HA 1 und 2 bzw.

35S:HA-COI1-98) mit 10 Pflanzen eines der COI1-Konstrukte (35S:HA-COI1, 35S:HA-COI1-85, 35S:HA-COI1-382, 35S:HA-COI1-441 sowie 35S:HA-COI1-466) für drei Wochen auf MS. Die Pflanzen wurden auf 1 %ige Wasser-Agarose-Platten umgelegt und mock-infiziert. Im Anschluss wurden von je zwei Platten jeweils 10 Wurzeln vereint. Für jedes Konstrukt wurden sieben Replikate präpariert und analysiert. Die Proteine COI1-382, COI1-441 und COI1-466 werden als funktional bezüglich der Repression des Phosphoglyceratmutase-Gens in der coi1-16-Mutante eingeschätzt (Abbildung 3.32).

Ergebnisse

Abbildung 3.32 Quantitative RT-PCR der Phosphoglyceratmutase in mock-infizierten Wurzeln von COI1-Mutanten

Genexpressionsanalysen in Wurzeln von 3 Wochen alten, steril auf MS-Medium angezogenen Pflanzen 4 Tage nach mock-Infektion. Jeweils 10 Pflanzen einer Referenzlinie wuchsen mit 10 Pflanzen einer Linie der COI1-Derivate side by side auf einer Platte. Gezeigt sind Mittelwerte von 7 Replikaten (± SEM) mit 20 Wur-zeln / Replikat. Die relativen Transkriptmengen wurden gegen die Expression von UBQ5 normalisiert. Die relative Transkriptmenge der Leervektorkontrolle (35S:HA 1) wurde gleich 1 gesetzt. Unterschiedliche Buch-staben zeigen signifikante Unterschiede mit einem p-Wert < 0,05 an (unpaired two-tailed Student t-test).

Bei 35S:HA-COI1-85 handelt es sich um eine heterozygote Linie.

Diese Analysen zeigen, dass ein COI1-Protein, das in der Pflanze JA-Ile-abhängige Funktionen wie Fer-tilität, JA-sensitives Wurzelwachstum und JA-induzierbare JAZ10-Expression nicht mehr ausführen kann, zur Repression von Genen beitragen kann, die in der coi1-Mutante erhöht exprimiert werden kann.

3.6 Analyse der Krankheitsphänotypen verschiedener Mutanten nach Infektion