Tiermodell

In dieser Studie wurden Meerschweinchen (Cavia aperea pocellus) als Tiermodell genutzt, da dies ein in der Hör- und insbesondere CI-Forschung etabliertes Tiermodell ist. Die Tierversuche wurden entsprechend der Richtlinien des Rates der europäischen Gemeinschaft 86/609/EEC und dem deutschen Tierschutzgesetz und mit der Genehmigung durch das Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit des Landes Niedersachsen durchgeführt. Die Dunkin-Hartley-Meerschweinchen wurden von „Charles River Laboratories International“ (Sulzfeld, Deutschland) bezogen und wurden in den Räumen des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten.

Für den Versuch wurden 60 männliche Meerschweinchen mit einem Mindestgewicht von 325 g implantiert.

35 3.1.3 Studiendesign

Für diese Studie wurden Meerschweinchen mit dem oben beschriebenen (vgl.

Kap. 3.1.1.) CI-Modell für einen Zeitraum von 28 Tagen (± 1 Tag) implantiert. Dabei wurde dieses bei der Hälfte der Tiere durch eine Inzision in der Rundfenstermembran (round window membrane, RWM) in die Cochlea geschoben, bei der anderen Hälfte wurde als Zugang eine Cochleostomie (CS) in der basalen Windung gewählt. Beide Insertionsarten wurden mit drei verschiedenen Verschlusstechniken kombiniert. So wurde die Insertionsstelle entweder offen gelassen (kein Verschluss, KV), mit aus der Operationswunde entnommenem Muskelgewebe (Muskelverschluss, MV) oder mit Carboxylatzement (Durelon^TM, 3M ESPE AG, Seefeld, Germany; Durelon^TM Verschluss, DV) verschlossen (zur Übersicht siehe Abb. 14).

Abb. 14: Abbildung des Studiendesigns.

Es sind die beiden Insertionsorte: Rundfenstermembran (RWM) und Cochleostomie (CS) sowie die 3 Verschlussarten: kein Verschluss (KV), Muskelverschluss (MV) und Durelon™-Verschluss (DV) dargestellt. Die Pfeile zeigen auf das runde Fenster und der Kreis markiert die Cochleostomie.

1 modifiziert nach KANDEL et al. 2000.

36 3.1.4 Narkose

Alle Eingriffe an den Tieren sowohl an Tag 0 (ABR-Messung und Implantation) als auch an Tag 28 (ABR-Messung und Perfusion) fanden unter Narkose statt.

Initial erhielten die Tiere eine intramuskuläre (i.m.) Injektion einer Mischung aus 0,025 mg/kg Körpergewicht (KGW) Fentanylcitrat (Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Deutschland), 0,2 mg/kg KGW Medetominhydrochlorid (Domitor^®, Pfizer GmbH, Berlin, Deutschland) und 1,0 mg/kg KGW Midazolam (Ratiopharm GmbH, Ulm, Deutschland). Zur Stabilisierung des Kreislaufes erhielten die Tiere eine subcutane (s.c.) Injektion mit 0,05 mg/kg KGW Atropinsulfat (B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland). Als Analgetikum wurde Carprofen (Rimadyl^®, Pfizer GmbH) in einer Dosierung von 5 mg/kg KGW s.c. verabreicht. Um einem Flüssigkeits- und Energiedefizit vorzubeugen, bekamen die Meerschweinchen als Flüssigkeitsdepots vor und nach der Operation (OP) jeweils 26 mL/kg KGW s.c.

RingerAcetat + Glucose 5 % in einem Mischungsverhältnis von 1:1. Als antibiotische Metaphylaxe wurde den Tieren 10 mg/kg KGW Enrofloxacin (Baytril^®, Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) an Tag 0 s.c. und an den 5 folgenden Tagen per os verabreicht.

An Tag 0, nach Abschluss des operativen Eingriffes, wurde die Narkose mit einer i.m. Injektion antagonisiert. Folgende Antagonisten wurden dabei verwendet:

1,0 mg/kg KGW Naloxon (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland) zusammen mit 0,1 mg/kg KGW Flumazenil (Inresa Arzneimittel GmbH) und 0,03 mg/kg KGW Atipamezolhydrochlorid (Antisedan^®, Pfizer GmbH).

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3.1.5 Messungen der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale

An Tag 0 direkt vor der Implantation und an Tag 28 kurz vor der Perfusion wurden bei den Tieren akustisch evozierte Hirnstammpotentiale (auditory brainstem responses, ABR) gemessen. Diese dienten der Bestimmung des Hörvermögens.

Die Stimulation erfolgte über ein Mikrophon, welches über eine dafür adaptierte, akustisch kalibrierte Pipettenspitze mit dem äußeren Gehörgang verbunden war. Die akustischen Signale wurden mit einem TDT-System (Tucker-Davies-Technology, Alahua, USA) generiert. Die evozierten Potentiale wurden mit der dazugehörigen Software (BioSigRP software) mittels subcutaner Nadelelektroden (CareFusion Nicolet, CareFusion Corporation, San Diego, USA) abgeleitet. Diese waren jeweils am linken und rechten Mastoid platziert. Die Referenzelektrode befand sich am Vertex und die Erdung im Nacken. Die beiden Ohren wurden separat stimuliert und die Hörschwellen einzeln bestimmt.

Als Stimulus wurden kurze Tonsignale (Reintöne mit einer Dauer von 10 ms und einem An- und Abschwellen des Tons innerhalb von 1 ms) in den Frequenzen 1, 4, 8, 16, 32 und 40 kHz bei Schalldruckpegeln von 0-90 dB SPL in Schritten von 10 dB verwendet, wobei jede Frequenz-Schalldruckpegel-Kombination 85-mal präsentiert wurde. Dabei wurden die aufgenommenen Signale 20-fach verstärkt, digitalisiert und bandpassgefiltert (300-3000 Hz), um das Hintergrundrauschen zu unterdrücken. Zusätzlich wurden alle Messungen dreimal wiederholt und die aufgenommenen Potentiale für jede Wiederholung direkt gemittelt (= 3 x Mittelwert aus 85 Ableitungen). Die so generierten Daten wurden in einer Textdatei gespeichert. Diese wurde mittels des ABR Analysis Tools© (Clemens Wendt, 2012) in Excel (Microsoft Corp., Redmond, USA) importiert. In diesem Programm wurden die drei Datensätze gemittelt und für jede Frequenz und Intensität ein Graph erstellt.

Die Intensität, bei der eine visuell erkennbare ABR-Kurve detektierbar war, wurde als Hörschwelle definiert (Abb. 15).

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Abb. 15: ABR-Kurven eines Meerschweinchens an Tag 0 (vor der Implantation).

Die Hörschwelle lag bei 30 dB SPL (dick umrandeter Graph). Der Pfeil zeigt auf den entsprechenden Peak.

39 3.1.6 Implantation

Im Anschluss an die ABR-Messungen an Tag 0 wurden die Tiere unter sterilen Bedingungen linksseitig implantiert.

Nach einer postaurikulären Inzision der Haut wurde der Musculus temporalis soweit wegpräpariert, bis die Bulla tympanica gut sichtbar war. Diese wurde mit der Spitze eines 11er-Skalpells (Feather Safety Razor Co., Ltd., Japan) perforiert und die Öffnung anschließend mit einer Pinzette so erweitert, dass eine gute Sicht auf die Cochlea gewährleistet war. Für eine bessere Erreichbarkeit des runden Fensters wurde der knöcherne Überhang entfernt. Bei einer Insertion durch die Rundfenstermembran (RWM) wurde die Membran vorher mit einer Lanzette unter mikroskopischer Kontrolle inzisiert und anschließend das CI-Modell in die Cochlea hineingeschoben (Abb. 16A). Bei einer Insertion durch eine Cochleostomie (Abb. 16B) wurde statt der Eröffnung des runden Fensters ein Loch in die knöcherne Wand der basalen Windung der Cochlea gebohrt. Dies erfolgte mittels eines Diamantkopfbohrers (Aesculap) mit einem Durchmesser von 0,6 mm bei ca.

40000 U/min.

Abb. 16: Operationsbilder mit CI-Modell in situ ohne Verschluss.

Der weiße Pfeil zeigt auf das runde Fenster, der schwarze auf das CI-Modell. A: Insertion durch die RWM. B: Insertion durch eine Cochleostomie (schwarzer Kreis).

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Nach der Einführung des CI-Modells wurde die Insertionsstelle entweder nicht weiter verschlossen (kein Verschluss, KV) oder mit einem aus dem Operationsfeld gewonnenen Muskelstück (Muskelverschluss, MV) bzw. Carboxylatzement (Durelon^TM-Verschluss, DV) verschlossen. Der Bulladefekt wurde in allen Gruppen mit Durelon^TM verschlossen. Anschließend wurden Muskel und Haut mit Einzelheften vernäht. Für die Muskelnaht wurde resorbierbares Nahtmaterial (Vicryl; Johnson &

Johnson MEDICAL GmbH, Norderstedt, Deutschland) und für die Hauthefte wurden nicht-resorbierbare Fäden (Seralon; SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG, Naila, Deutschland) verwendet. Die Hauthefte wurden ca. 10 Tage nach der Implantation entfernt.

3.1.7 Perfusion und Einbettung

An Tag 28 im Anschluss an die ABR-Messungen wurden die Tiere in tiefer Narkose transkardial perfundiert. Zuerst wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung (Phosphat Buffered Saline, PBS) gespült und anschließend das Gewebe mit modifizierter Wittmaak’s Fixierlösung fixiert. Die Felsenbeine wurden gewonnen und unter einem Mikroskop soweit eröffnet, dass eine gute Sicht auf die Cochlea möglich war. Bevor die Cochleae zur Nachfixierung erneut in mod. Wittmaak’s Fixierlösung gelegt wurden, wurde der Apex mit einer Lanzette eröffnet, um ein besseres Eindringen von Fixierlösung und später Epoxid zu gewährleisten. Nach 18 h in Fixierlösung erfolgte ein 18-stündiger Waschschritt mit 5 % Litiumsulfat (Merck KGaA). Im Anschluss daran wurden die Cochleae mit aufsteigender Alkoholreihe entwässert (50, 70, 90 und 100 %) und vor dem Einbetten noch einmal mit TEK M E k (Struers GmbH, Willich, Deutschland) gespült. Als Einbettmedium wurde ein Epoxidharz (Spezifix-40, Struers GmbH) verwendet. Um ein Durchscheinen von tiefer gelegenen Schichten zu verhindern, wurde dem Epoxid noch weiße Farbe (EP-Farbpaste weiß, MBFZ toolcraft GmbH, Georgensgmünd, Deutschland) beigemischt.

Die Felsenbeine wurden in eine aus Epoxid gefertigte Halterung überführt und darin so ausgerichtet, dass das runde Fenster nach unten zeigte und der Modiolus parallel zur Schliffebene lag. In dieser Postition wurde die Probe mit Sekundenkleber fixiert. Anschließend wurde die Halterung mitsamt dem Felsenbein in eine Silikonform gestellt und dort mit dem weißen Epoxidharz übergossen. Nachdem die

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Luftblasen in einem Exsikkator (Duran^® Exsikkator, Omnilab-Laborzentrum GmbG &

Co. KG, Bremen, Deutschland; mit Vakuumpumpe, Vaccubrand GmbH + Co KG, Wertheim, Deutschland) aus der Cochlea abgezogen worden waren, härtete das Epoxid bei Raumtemperatur für mindestens 24 h aus.

3.1.8 Histologie

Die Epoxidblöcke (Abb. 17) wurden in einen 6er-Probenhalter gespannt und mit dem Schleifgerät PowerProTM 4000 (Buehler GmbH, Düsseldorf, Germany) geschliffen. Das Siliziumcarbid-Nassschleifpapier (Buehler GmbH) hatte eine Körnung von P 1200. Dabei wurden folgende Einstellungen genutzt: Geschwindigkeit 300 U/min, ein Zentralandruck von 120 N sowie ein Abtrag von 40 µm.

Abb. 17: Ansicht der Schlifffläche eines Epoxidblockes mit eingebetteter Cochlea.

Nach jedem Abtrag wurde die Schlifffläche mit Wasser abgespült, getrocknet und die Oberfläche mit Kallichrom (Waldeck GmbH & Co. KG, Münster, Germany) für 90 s gefärbt. Dies führte zu einer dunkelblauen Darstellung der Zellkerne, einer Blaufärbung des Bindegewebes und, bedingt durch die Fixierlösung, einer graugrünen Darstellung des Knochengewebes. Nach einem erneuten Abspülen und Trocknen wurde die Oberfläche mit einem VHX-600 DSO Mikroskopsystem (Keyence Deutschland GmbH, Neu-Isenburg, Deutschland) dokumentiert. Dabei wurden Übersichtsaufnahmen der Cochlea in 30- und 50-facher Vergrößerung sowie Detailaufnahmen mit 100- und 200-facher Vergrößerung erstellt. Dieser Ablauf wurde

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wiederholt, bis die gesamte Cochlea abgetragen und dokumentiert war. In den so gewonnenen Aufnahmen (Abb. 18A) wurde in jeder zweiten Ebene die Fläche des Bindegewebes und des neugebildeten Knochengewebes mit der VHX-2000 communication software (Keyence Deutschland GmbH) ausgemessen (Abb. 18B).

Um das Volumen des neu gebildeten Gewebes zu ermitteln, wurden diese Flächen mit dem Abtrag multipliziert und anschließend aufaddiert und in µL umgerechnet.

Abb. 18: Schliffbild einer linken Cochlea.

Der Messbalken entspricht 250 µm. Der Pfeil zeigt auf die Basilarmembran. =CI-Modell, SV=scala vestibuli, ST=scala tympani, RK=Rosenthal’scher Kanal, HN=Hörnerv. A: Original-Aufnahme; B:

Ausgemessen, 1+2=freie Fläche; 3+4=Bindegewebe; 5=Knochengewebe, 6=Elektrodenmodell

43 3.1.9 Auswertung

In diese Studie wurden nur Tiere eingeschossen, deren Hörschwelle am Punkt des sensitivsten Hörens bei Meerschweinchen (8-16 kHz) unter 50 dB SPL lag und die 28 Tage lang implantiert waren. Ausschlusskriterien waren Hinweise auf Infektionen des Innenohres oder schwere mechanische Traumata durch die Insertion wie etwa Schäden am Modiolus. Somit wurden die Daten von jeweils 5 Tieren pro Gruppe ausgewertet.

Die statistischen Auswertungen sowie die Erstellung der Graphen erfolgten mittels der Prism software (GraphPad Software, Inc.). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt.

Tiere, bei denen an Tag 0 bei einzelnen Frequenzen keine Hörschwelle detektiert werden konnten, sind bei sämtlichen statistischen Auswertungen diese Frequenz betreffend ausgenommen. Aus diesem Grund wurde die Hörschwelle bei 1 kHz nicht statistisch ausgewertet. Eine Übersicht zu der Anzahl der Tiere und den betroffenen Frequenzen gibt Tab. 2.

Tab. 2: Anzahl der Ohren pro Gruppe, deren Hörschwelle an Tag 0 nicht bestimmt werden konnte, im Vergleich zur Anzahl der Ohren pro Gruppe.

1 kHz 4 kHz 8 kHz 16 kHz 32 kHz 40 kHz

Kontrolle= nicht implantierte Ohren

In Anlehnung an BALKANY et al. (2006) wurde für alle Hörschwellen, die an Tag 28 oberhalb des Mess- bzw. Stimulationsbereichs (90 dB SPL) lagen, ein artifizieller Datenpunkt (100 dB SPL) eingeführt. Aufgrund des geringen Stichprobenumfangs (n = 5 pro Gruppe) bzw. ungleicher Anzahl Tiere pro Gruppe wurden nicht-parametrische Tests bei der statistischen Analyse der Daten

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durchgeführt. Dabei wurde zuerst ein Gruppenvergleich mittels eines zweiseitigen Kruskall-Wallis-Tests durchgeführt. Ergaben sich dabei signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (p < 0,05), so wurde der Ursprung dieser Unterschiede mittels Mann-Whitney-U-Tests (zweiseitig) ermittelt. Um auf eine statistisch signifikante Korrelation zwischen Hörschwelle und Menge an Gewebe zu testen, wurde ein Spearman-Rho-Test durchgeführt. Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α < 0,05 wurden als signifikant angesehen.

3.2 Nanopartikel-Silikon-Komposite

3.2.1 Flachproben aus Nanopartikel-Silikon-Kompositen

Die Nanopartikel-Silikon-Komposite (NSK) wurden im Laser Zentrum Hannover e.V. mit demselben Verfahren hergestellt wie von HAHN et al. 2010 beschrieben. Dabei wurden metallische Nanopartikel in einer Größe zwischen 3 - 20 nm mit einem Femtosekundenlaser in einem Gemisch aus n-Hexan als Lösungsmittel und 1 % der Resin-Komponente des mediznischen Silikons NuSil^TM MED-4234 (NuSil Technology LLC) hergestellt. Im Anschluss wurde dieses Gemisch mit einer weiteren, der gewünschten Endkonzentration entsprechenden Menge des Resins vermischt und das n-Hexan unter Vakuum abgesaugt. Anschließend wurde die Vernetzerkomponente des Silikons in einem Mischungsverhältnis von 1:10 der Flüssigkeit beigemischt. Die so entstandene Masse wurde blasenfrei auf einer Folie ausgestrichen und mit einer weiteren Folie bedeckt, sodass eine Schichtdicke von ca. 1 mm erreicht wurde. Diese Schicht wurde für 1,5 h bei 110 °C ausgehärtet.

Anschließend wurden Flachproben mit einem Durchmesser von 6 mm ausgestanzt.

Hergestellt wurden Flachproben mit je einem der Metalle Silber (Ag), Kupfer (Cu) oder Zink (Zn). Die Komposite wurden dabei mit einer Nanopartikelkonzentration von 0,1; 0,2; 0,5 und 1 Gewichtsprozent (Gew%), sowie für Zn auch noch mit 2 und 3 Gew% hergestellt (siehe Abb. 19). Außerdem wurden auch Flachproben mit Kombinationen aus zwei verschiedenen Metallen (Ag+Zn, Ag+Cu, Ag+Au (Gold)) in einem Mischungsverhältnis von 1:1 mit einer NP-Gesamtkonzentration von 0,2 Gew% und 0,5 Gew% im Komposit hergestellt. Zusätzlich wurden reine Silikonproben hergestellt und als Silikon-Referenz genutzt. Um einen möglichen

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Einfluss von n-Hexan-Rückständen auszuschließen, wurden bei jedem Herstellungsvorgang auch Proben hergestellt, in die n-Hexan wie bei der Herstellung der Komposite mit eingemischt und danach wieder entfernt wurde.

Abb. 19: NSK-Flachproben sowie Referenzen.

Die Zahlen geben Gewichtsprozent der NP im Komposit in der vertikalen Reihe an. Die gestrichelten Kreise zeichnen die Umrisse der Flachproben nach. Die obere Reihe zeigt die Ag-Komposite, die zweite Zn-Komposite und die dritte Cu-Komposite. In der untersten Reihe sind links die Silikonreferenz und rechts die n-Hexan-Referenz lokalisiert.

3.2.2 Zellkultur

In dieser Studie wurden immortalisierte Mausfibroblasten (NIH/3T3, ATTC Nr.

CRL 1658) verwendet (Abb. 20). Diese Zelllinie wird häufig zur Testung der Zytotoxizität von Metallsalzen auf Fibroblasten genutzt (YAMAMOTO et al. 1998;

PAASCHE et al. 2011). Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2-Anteil kultiviert. Die Anzucht erfolgte in 25 cm² großen Zellkulturflaschen (TPP, Biochrom AG, Berlin, Deutschland) mit Dulbecco’s modified Eagles Medium (DMEM, Biochrom AG) komplementiert mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS, Biochrom AG) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Biochrom AG).

Für die Versuche wurden Zellen der Passagen 5-25 verwendet, um eine Vergleichbarkeit mit den in diesem Labor durchgeführten Tests der entsprechenden

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Metallsalze (PAASCHE et al. 2011) zu ermöglichen. Passagiert wurden die Zellen kurz vor Erreichen der Konfluenz. Dabei wurde das Medium mit einer Glaspipette (Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Deutschland) abgesaugt. Daraufhin wurden die Zellen mit 5 mL HANK’S Salzlösung (Biochrom AG) gewaschen. Anschließend wurden bei 37 °C 0,5 mL Trypsin/EDTA-Lösung (0,05 %/0,02 %; Biochrom AG) auf die Zellen gegeben. Da das Trypsin nicht nur extra-, sondern auch intrazelluläre Proteine verdaut, wurde die Trypsinreaktion nach 4 min mit 1 mL komplementiertem Medium gestoppt. So wurde die Haftung der Zellen zum Boden gelöst und sie kugelten sich ab. Nach dem Stoppen der Trypsinreaktion wurde eine Zellzahlbestimmung durchgeführt. Dabei wurden 10 µL Zellsuspension mit 10 µL komplementiertem Medium verdünnt und mit 3 µL Trypanblau (0,5 % w/v; Biochrom AG) gefärbt. In einer Neubauer-Zählkammer wurden die vitalen (nicht mit Trypanblau angefärbten) Zellen gezählt und die Konzentration in der Zellsuspension berechnet.

Anschließend wurden die Zellen mit komplementiertem Medium auf die für den Versuch benötigte Konzentration verdünnt und in die Wells eingesät oder zur Weiterzucht in eine neue Zellkulturflasche überführt und mit insgesamt 5 mL komplementiertem Medium bis zur nächsten Passagierung im Brutschrank gelagert.

Abb. 20: NIH 3T3-Fibroblasten.

10-fache Vergrößerung, der Messbalken zeigt 100 µm an.

47 3.2.3 Neutralrot-Test

Der Neutralrot-Test ist ein von BORENFREUND und PUERNER 1985 als Alternative zum Draize-Test vorgestelltes Verfahren zur Zytotoxizitätsbestimmung.

Der Lebendfarbstoff dringt in die Zellen ein und akkumuliert in den Lysosomen lebendiger Zellen. Es ist ein für 3T3-Zellen etabliertes Verfahren, um relative Zellzahlbestimmungen durchzuführen (PAASCHE et al. 2011).

Eine Neutralrot-Stammlösung mit einer Konzentration von 4 mg Neutralrotpulver (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) in 1 mL bidestilliertem Wasser wurde angesetzt und lichtgeschützt bei +4 °C gelagert. Aus dieser Stocklösung wurde für jeden Versuch frisch ein Ansatz mit einer Konzentration von 0,008 mg/mL mit komplementiertem Medium hergestellt. Von dieser Gebrauchslösung wurden zusätzlich zu dem dort befindlichem Medium 100 µL in die Wells gegeben. Während der Inkubationszeit von 3 h wurde der Farbstoff nur in den Lysosomen von lebenden Zellen akkumuliert, da in toten Zellen die Lysosomenmembran nicht mehr intakt ist. Anschließend wurden die Zellkulturplatten mit 1000 U/min bei +4 °C für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert. Dabei wurde der gesamte Farbstoff, der nicht in den Lysosomen lebendiger Zellen akkumuliert war, entfernt. Um evtl. von außen an den Zellen haftenden Farbstoff zu lösen, wurden die Zellen mit 100 µL einer Lösung aus 1 % CaCl2 und 0,5 % Formaldehyd (beides Merck KGaA) gewaschen. Anschließend wurde erneut wie oben beschrieben zentrifugiert und der Überstand mit den freien Farbresten entfernt. Zur Lyse der Zellen und damit der Freisetzung des Farbstoffs aus den Zellen wurden 100 µL eines Gemisches aus 1 % Essigsäure (Merck KGaA) und 50 % Ethanol (Ethanol vergällt mit 1 % Methylethylketon 99 % abs.; Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen, Deutschland) in die Wells pipettiert. Anschließend wurden die Platten für 30 s auf einem Rüttler bei 500 U/min gerüttelt und für 10 min bei 4 °C gelagert. Je nach Anzahl der lebenden Zellen pro Well wurde dabei mehr oder weniger Farbstoff freigesetzt und die Farbintensität des Überstandes variierte entsprechend. Vergleicht man die fotometrischen Messwerte mit einem Referenzwert z. B. der Einsaatkontrolle, kann aus der Farbintensität die dazu prozentuale Menge an lebenden Zellen (Viabilität) berechnet werden. Das Absorptionsmaximum des Farbstoffes liegt bei einer Wellenlänge von 570 nm. In dieser Studie wurden die

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fotometrischen Messungen mit einem Multiskan Ascent Reader (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) durchgeführt.

3.2.4 Studiendesign Nanopartikel-Silikon-Komposite

Flachproben aus NSK mit unterschiedlichen inkorporierten Metallen und Konzentrationen (Abb. 12) wurden auf ihren Einfluss auf die Viabilität von NIH/3T3 Zellen untersucht. Dabei wurde die Viabilität ins Verhältnis zur Einsaatkontrolle (Wachstum auf Polysterol, Well-Boden) bzw. einer Silikonreferenz gesetzt.

Außerdem wurde der Einfluss möglicher Reste des Lösungsmittels n-Hexan in den Kompositen getestet. In Tabelle 3 sind die unterschiedlichen getesteten Metalle und Konzentrationen mit der jeweiligen Strichprobengröße aufgeführt.

Tab. 3: Anzahl an Flachproben, die getestet wurden.

Das Mischverhältnis der Kombinationen war 1 : 1.

Ag Cu Zn Ag+Au Ag+Cu Ag+Zn

0,1 Gew% 20 20 40 - - -

0,2 Gew% 20 20 20 20 20 20

0,5 Gew% 20 20 40 20 20 20

1,0 Gew% 20 40 40 - - -

2,0 Gew% - - 20 - - -

3.2.5 Versuchsablauf

Die Flachproben wurden in eine 96-Well Platte (TPP, Biochrom AG) verbracht.

Diese Platten wurden dann einzeln verpackt mit Ethylenoxid 6 % und bei 40 °C sterilisiert. Es wurden immer 5 Flachproben pro Gruppe in einer Platte und jeweils 4 Platten in einem Ansatz getestet. In jeder Platte wurden zusätzlich zu den NSK auch jeweils 5 Flachproben aus dem verwendeten Silikon sowie 5 Flachproben aus Silikon mit eingemischtem und anschließend wieder abgezogenem n-Hexan getestet. Als Einsaatkontrolle wurden in weitere 5 Wells ohne Flachproben ebenfalls Zellen eingesät. Um die zu testenden Wells herum wurde ein Kranz aus angrenzenden Wells mit 100 µL des komplementierten Zellkulturmediums befüllt, um einen

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möglichen Einfluss durch die Lokalisation auf der Platte (sind die benachbarten Wells leer oder auch mit Flüssigkeit gefüllt?) auf die Ergebnisse zu kontrollieren.

Zu Beginn des Versuches wurden 60 µL komplementiertes Zellkulturmedium in alle zu testenden Wells (inklusive Einsaatkontrolle) gegeben. Die Platten wurden danach für 24 h unter denselben Bedingungen wie die Zellen inkubiert, um ein Eindringen von Flüssigkeit in die Nanopartikel-Silikon-Komposite zu ermöglichen.

Dadurch sollten der Korrosionsprozess und die damit verbundene Freisetzung von Metall-Ionen bereits beginnen, bevor nach 24 h die Zellen auf den Kompositen ausgesät wurden. Es wurden 40 µL einer Zellsuspension mit 250 Zellen/µL in die Wells pipettiert, wodurch pro Well eine Konzentration von 10⁴ Zellen/100 µL erreicht wurde. Die eingesäte Zellzahl entspricht der Zellzahl, die auch für die Evaluation der Metallsalze (PAASCHE et al. 2011) in unserem Labor genutzt wurde, und führt zu einer Testung proliferierender Zellen. Nach 48 h Inkubationszeit wurden 100 µL einer Neutralrot-Lösung (0,008 mg/mL) zu den Zellen gegeben und ein Neutralrot-Test durchgeführt. Vor der Durchführung der fotometrischen Messungen wurden 70 µL des Überstands aus den Wells in neue Wells übertragen, um einen Einfluss der farbigen Flachproben (siehe Abb. 19) auf die fotometrische Messung zu verhindern.

3.2.6 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung und Erstellung der Graphen erfolgte mit der Prism Software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA). Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. Aufgrund der nicht immer gegebenen Normalverteilung (getestet mit Kolmogorov-Smirnoff) wurden nicht-parametrische Tests durchgeführt.

Um Unterschiede zwischen den Gruppen zu detektieren, wurde zuerst ein Kruskal-Wallis-Test durchgeführt. Zeigte dieser einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen auf, wurden die einzelnen Nanopartikel-Silikon-Komposite in ihrer jeweiligen Konzentration mittels Mann-Whitney-U-Test auf einen Unterschied zur Referenz bzw. Einsaatkontrolle getestet. Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α < 0,05 wurden als signifikant angesehen.

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4. Resultate

4.1 Insertionsstudie

Nach Auswertung der Hörschwellen an Tag 0 sowie Beurteilung des mechanischen Traumas (vgl. Kap. 3.1.9) wurden 30 Tiere (5 pro Gruppe) in die Auswertung dieser Studie einbezogen. Ein Tier hatte den Punkt des besten Hörens

Nach Auswertung der Hörschwellen an Tag 0 sowie Beurteilung des mechanischen Traumas (vgl. Kap. 3.1.9) wurden 30 Tiere (5 pro Gruppe) in die Auswertung dieser Studie einbezogen. Ein Tier hatte den Punkt des besten Hörens

Im Dokument Einflussfaktoren auf proliferative Vorgänge nach Cochlea Implantation (Seite 48-0)