Templatgesteuerte chemische PNA-Verknüpfung am H-Ras-Templat

Die Sondenpaare 112 + 115 (N = 7), 112 + 116 (N = 10) und 114 + 115 (N = 11) wurden anschließend in templatgesteuerten Reaktionen mit dem perfekt komplementären DNA-Templat Ras-mt umgesetzt. Zur Bestimmung der Einzelbasenspezifität und der Hintergrund-rate wurden zusätzlich Reaktionen mit dem einzelbasenfehlpaarenden Templat Ras-wt sowie in Abwesenheit eines Templats angesetzt. Vor jeder Reaktion erfolgte eine Umwandlung der PNA-Mercaptopropionsäurethioester in die reaktiveren 2-Mercaptoethansulfonsäure-Thioester (MESNA-2-Mercaptoethansulfonsäure-Thioester) durch dreistündiges Schütteln im Reaktionspuffer, dem 10 mM Natrium-2-mercaptoethansulfonat (MESNa) zugesetzt waren. MESNa diente ebenfalls als Reduktionsmittel, um eventuell gebildete Disulfide der Isocysteinyl-PNAs zu reduzieren.

Daher wurden diese vor Beginn der Reaktion ebenfalls für 1 h getrennt von den Thioestern im Reaktionspuffer inkubiert. Die Umsetzungen fanden bei einer Konzentration von 1 µM und einer Temperatur von 50 °C statt und wurden am Fluoreszenzspektrometer zeitabhängig verfolgt. Dazu wurde der FAM-Fluorophor bei 470 nm angeregt und die Emissionen bei 523 nm (F523, FAM) und 585 nm (F585, TMR) ausgelesen. Der berechnete Quotient (F585/F523)t/(F585/F523)t = 0 (im Folgenden als FRET-Signal bezeichnet) stellt über die Zeit aufgetragen ein Maß für das Fortschreiten der Reaktionen dar. Während das FRET-Signal in Abwesenheit von DNA für alle Sondenpaare annähernd konstant blieb, stieg es in Gegenwart des komplementären Templats Ras-mt bei der Umsetzung von 112 mit 116 nach 1 h auf einen Wert von 2.1 an. Dies war unter allen getesteten Verknüpfungsreaktionen der mit Abstand größte Anstieg (Abbildung 21). Aus dem Verhältnis der durch Ras-mt und Ras-wt verursachten Signalanstiege im linearen Anfangsstadium der Reaktionen ergab sich eine Einzelbasenspezifität von S = 10. Allerdings war die Anfangsrate des Signalanstiegs für die

Abbildung 21: Relative Änderung des FRET-Signals bei der Umsetzung der PNA-Thioester 112 oder 114 mit den iCys-PNAs 115 oder 116 (1 µM Sonden und ggf. DNA-Templat, 10 mM NaH2PO4, 10 mM MESNa, 150 mM NaCl, pH 7.4, T = 50 °C, ex. = 470 nm).

durch Ras-mt beschleunigte Reaktion von 112 und 116 mit 0.11 min^-1 recht klein. Da während der Anlagerungsschritte einer PCR nur sehr wenig Zeit für eine Reaktion zur Verfügung steht, sollten möglichst hohe Anfangsraten erzielt werden.

Ein anderes Problem stellte die auch bei niedrigen Konzentrationen von 1 µM weiterhin geringe Löslichkeit der TMR-markierten Isocysteinyl-PNAs dar. Eine Analyse der PNA-Sequenz ergab ein hohes Maß an Selbstkomplementarität, die durch sechs GC-Basenpaare hervorgerufen wird. Zusätzlich existieren vermutlich hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den aromatischen Systemen der TMR-Fluorophore sowie den Nukleobasen. Da solche homogenen Duplexe als Keime für höhermolekulare Aggregate wirken können, würde auf diese Weise eine Aggregation der PNAs begünstigt. Wahrscheinlich liegt darin auch der Grund für die sehr unterschiedlichen Signalanstiege der templatgesteuerten Verknüpfungen.

Offensichtlich liefern beide Reaktionen, in denen Isocysteinyl-PNA 115 involviert ist, deutlich kleinere Anstiege. Es ist möglich, dass die Anbindungsstelle des Fluorophors in 115 zu günstigeren hydrophoben Wechselwirkungen der Farbstoffe als in 116 führt und daher eine verstärkte Aggregation hervorruft. Somit stünde für eine Reaktion weniger gelöstes 115 zur Verfügung.

Die Einführung von positiv geladenen Gruppen könnte die Aggregation der Isocysteinyl-PNAs über elektrostatische Abstoßung und eine Erhöhung der Hydrophilie zurückdrängen.

Daher wurde die am C-Terminus mit drei Lysinen versehene Isocysteinyl-PNA 126 synthetisiert (Abbildung 22a). Die -Aminogruppen der Lysinreste liegen im neutralen pH-Bereich protoniert vor (pKs > 10). Die aus Denaturierungsexperimenten von 116 und 126 mit dem komplementären Templat Ras-mt erhaltenen Schmelzkurven ergaben jedoch in beiden

Abbildung 22: a) Schematische Darstellung der PNA-DNA-Duplexe aus der Sonde 116 bzw. aus der mit Lysinen modifizierten Sonde 126 und Ras-mt, sowie eines aus 126 gebildeten PNA-PNA-Duplexes.

b)−d) Schmelzkurven der TMR-markierten iCys-PNA-Konjugate 116 und 126 mit dem komplementären Templat Ras-mt sowie ohne Templat (500 nM Sonden und ggf. DNA-Templat, 10 mM TRIS, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH = 8.0,  = 260 nm, Dreifachmessungen).

erwarten wäre (Abbildung 22b, c). Ein Kontrollexperiment, bei dem 126 ohne das Templat untersucht wurde, lieferte einen ähnlichen Kurvenverlauf (Abbildung 22d). Die templat-vermittelte Umsetzung von 126 mit dem PNA-Thioester 112 ergab nur eine leichte Verbesserung des Signalanstiegs (Abbildung 23). Dieser kam jedoch in dem für eine Anwendung in der PCR wichtigen Anfangsstadium der Reaktion nicht zum Tragen. Die Einzelbasenspezifität war mit S = 10 genauso groß wie für die Umsetzung von 112 mit 116.

Zusammenfassend lässt sich aus den experimentellen Daten schließen, dass die Einführung der Lysinreste nur zu einer moderaten Solubilisierung der Isocysteinyl-PNA-Konjugate

Abbildung 23: Relative Änderung des FRET-Signals bei der Umsetzung des PNA-Thioesters 112 mit den iCys-PNAs 116 oder 126 (1 µM Sonden und ggf. DNA-Templat, 10 mM NaH2PO4, 10 mM MESNa, 150 mM NaCl, pH 7.4, T = 50 °C,  = 470 nm, R = (CH)SOH).

führte. Sie reichte offenbar nicht aus, um eine Aggregation der Sonden vollständig zu unterdrücken. Die Selbstkomplementarität und die damit verbundene Neigung zur Aggregation der Isocysteinyl-PNAs stellten in dem verwendeten Sequenzkontext ein inhärentes Problem dar. Beim Vergleich der Sequenz des in vorangegangenen Arbeiten[65,171,173,175] als Templat verwendeten H-Ras-Gensegments des Schweins mit der des hier genutzten Segments des Menschen fiel auf, dass sich zwei Einzelbasensubstitutionen (A→C, T→C) in der Bindungstelle der Isocysteinyl-PNAs befinden. Erst durch die auf der Sondenseite benötigten Guanine wurden die beiden selbstkomplementären Tripletts geschaffen, die nur durch eine Fehlpaarung separiert sind (vgl. Abbildung 22a). Zusätzlich verstärkte die größere Länge und der mit mehr als 50% hohe Purinanteil der PNA-Sonden deren Hydrophobizität. Eine Verschiebung der PNAs entlang des Templats wäre nicht empfehlenswert. Eine hohe Hybridisierungsdiskriminierung von einzelbasenfehlpaarender DNA ist nur für eine in der Mitte der Sonde befindliche Fehlpaarung zu erwarten.^[173] Die vielversprechendste Möglichkeit zur Umgehung der Selbstkomplementarität bot ein Wechsel der Zielsequenz. Im Folgenden wurden daher templatgesteuerte Reaktionen an einem DNA-Segment untersucht, welches die V600E-Einzelbasenmutation des menschlichen B-Raf-Gens umspannt.