Allgemeine Syntheseprotokolle

Erstbeladung von MBHA-Harz mit Fmoc- bzw. Fm-geschützten Aminosäuren: 250 mg MBHA-Harz HL (100−200 mesh, Beladungsgrad: 1.2 mmol∙g^-1, 300 µmol) wurden zum Quellen 1 h in 2 mL DMF geschüttelt. Anschließend wurde das Harz gewaschen (5× DMF, 5×

DMF/DIPEA (19:1, v:v, davon 2× 10 min), 10× DMF, je 2 mL) und über Nacht in einer Lösung aus 100 µmol der entsprechenden Aminosäure (29.7 mg Fmoc-Gly-OH, 58.6 mg Fmoc-Cys^Trt-OH oder 40.0 mg Boc-Cys^Fm-OH), 100 µmol PyBOP (52.0 mg) und 300 µmol NMM (33.0 µL) in 2 mL DMF geschüttelt. Es wurde erneut gewaschen (15× DMF, je 2 mL), 2× 5 min in DMF/2,6-Lutidin/Essigsäureanhydrid (89:6:5, v:v:v, je 2 mL) geschüttelt, gewaschen (5× DMF, 10× DCM, je 2 mL) und Lösungsmittelreste unter vermindertem Druck entfernt. Der Beladungsgrad wurde über die Abspaltung der Fmoc- bzw. der Fm-Schutz-gruppe UV-spektrometrisch bestimmt (Kapitel 6.2) und betrug 0.1−0.3 mmol∙g^-1.

Herstellung von mit S-Trt-Mercaptopropionsäure funktionalisiertem MBHA-Harz: Die Synthese erfolgte an 50 µmol mit Fmoc-Gly-OH beladenem MBHA-Harz. Zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurde das Harz 4× 5 min in einer Mischung aus Piperidin/DMF (1:4, v:v, je 2 mL) geschüttelt und gewaschen (15× DMF, je 2 mL). Anschließend wurde das Harz in einer Lösung aus 10 Äquiv. S-Trt-Mercaptopropionsäure (bezogen auf die Erstbeladung des eingesetzten Harzes, Endkonzentration: ca. 0.2 M), 10 Äquiv. PyBOP und 12 Äquiv. NMM in DMF 2× 30 min geschüttelt und gewaschen (5× DMF, je 2 mL). Zur Blockierung von nicht umgesetzten Aminofunktionen wurde das Harz 2× 5 min in 2 mL DMF/2,6-Lutidin/

Essigsäureanhydrid (89:6:5, v:v:v) geschüttelt, gewaschen (5× DMF, 10× DCM, je 2 mL) und Lösungsmittelreste unter vermindertem Druck entfernt.

Manuelle Festphasensynthese nach der Boc-Schutzgruppenstrategie: Je nach Synthese-maßstab wurde die entsprechende Menge beladenes MBHA-Harz in einen Reaktor eingewogen, zum Quellen 30 min in 1 mL DMF geschüttelt und gewaschen (5× DMF, je 1 mL). Als PNA-Monomere wurden Boc-a^Cbz-OH, Boc-c^Cbz-OH, Boc-g^Cbz-OH und Boc-t-OH

Initiale Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe: Das Harz wurde 4× 5 min in Piperidin/DMF (1:4, v:v, je 1 mL) geschüttelt und gewaschen (15× DMF, je 1 mL).

Abspaltung der N-terminalen Boc-Schutzgruppe: Das Harz wurde 5 min in 1 mL TFA/m-Kresol (19:1, v:v) geschüttelt und gewaschen (10× DCM, 5× DMF, je 1 mL).

Kupplung der Monomere: Das Harz wurde in einer Lösung aus 4 Äquiv. des geschützten Monomers (bezogen auf die Erstbeladung des eingesetzten Harzes, Endkonzentration: ca.

0.1 M), 4 Äquiv. PyBOP und 8 Äquiv. NMM in DMF 30 min geschüttelt und gewaschen (5×

DMF, je 1 mL). Wenn bei einer Synthese Abbruchsequenzen auftraten, wurde im nächsten Ansatz die Kupplung der entsprechenden PNA-Monomere bis zu 2× wiederholt.

Blockierung nicht umgesetzter Aminofunktionen: Das Harz wurde 3 min in 1 mL DMF/

2,6-Lutidin/Essigsäureanhydrid (89:6:5, v:v:v) geschüttelt und gewaschen (5× DMF, 10× DCM, je 1 mL).

Freisetzung vom Harz: Das Harz wurde gewaschen (5× DMF, 10× DCM, je 1 mL). Methode A: Das Harz wurde 3 h in 700 µL TFA/TFMSA/m-Kresol (16:3:1, v:v:v) geschüttelt.

Anschließend wurde 3× mit je 300 µL TFA extrahiert. Methode B: Das Harz wurde 3× 5 min in 1 mL TFA/TIS/m-Kresol (18:1:1, v:v:v) geschüttelt. Anschließend wurde wie bei Methode A verfahren.

Reinigung: Die vereinigten Abspalt- und Extraktionslösungen wurden unter vermindertem Druck auf ca. 100 µL eingeengt. Die Fällung der Rohprodukte erfolgte durch die Zugabe von 1.5 mL kaltem Diethylether. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und der Rückstand erneut in 1.5 mL kaltem Diethylether suspendiert (Ultraschallbad). Nach der Zentrifugation wurde der erhaltene Feststoff im Argonstrom getrocknet und in Wasser oder in Wasser/Acetonitril/TFA (max. 50 vol% Acetonitril und 1 vol% TFA) aufgenommen. Nach der Reinigung mittels semi-präparativer HPLC wurden die über MALDI/TOF-MS oder ESI-MS identifizierten Produktfraktionen vereint, in flüssigem Stickstoff gefroren und durch Gefriertrocknung vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde in entgastem Wasser aufgenommen und die Konzentration UV/Vis-spektroskopisch bestimmt (Kapitel 6.2).

Automatisierte Festphasensynthese nach der Fmoc-Schutzgruppenstrategie: Je nach Synthesemaßstab wurde die entsprechende Menge beladenes MBHA-Harz oder unbeladenes Tentagel^® Rink Amid-Harz (Linker: 0.180 mmol∙g^-1) in einen microscale column-Reaktor

eingewogen, zum Quellen 30 min in 150 µL DMF suspendiert und im Syntheseautomaten platziert. Als PNA-Monomere wurden Fmoc-a^Bhoc-OH, Fmoc-c^Bhoc-OH, Fmoc-g^Bhoc-OH und Fmoc-t-OH verwendet.

Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe: Das Harz wurde 2× 2 min mit Piperidin/

DMF (1:4, v:v, je 250 µL) behandelt und gewaschen (5× DMF, je 300 µL).

Kupplung der Monomere: Das Harz wurde 2× 30 min mit einer Lösung aus 4 Äquiv. des Monomers (bezogen auf die Erstbeladung des eingesetzten Harzes, Endkonzentration: ca.

0.14 M), 3.6 Äquiv. HBTU oder HCTU (für Aminosäuren wurden 3.6 Äquiv. HOBt zugesetzt) und 12 Äquiv. NMM in NMP versetzt und gewaschen (5× DMF, je 300 µL).

Blockierung nicht umgesetzter Aminofunktionen: Das Harz wurde 3 min mit 250 µL DMF/

2,6-Lutidin/Essigsäureanhydrid (89:6:5, v:v:v) behandelt und gewaschen (5× DMF, je 300 µL).

Freisetzung vom Harz: Das Harz wurde in einen Spritzenreaktor überführt. MBHA-Harz: Die Freisetzung vom Harz erfolgte analog zu Methode B für die manuelle Festphasensynthese nach der Boc-Schutzgruppenstrategie. TentaGel^® Rink Amid-Harz: Das Harz wurde gewaschen (5× DMF, 10× DCM, je 1 mL) und 1.5 h in 700 µL TFA/TIS/Wasser (18:1:1, v:v:v) geschüttelt. Anschließend wurde 3× mit je 300 µL TFA extrahiert.

Reinigung: Die Reinigung erfolgte wie für die durch manuelle Festphasensynthese nach der Boc-Schutzgruppenstrategie hergestellten PNA-Konjugate beschrieben.

Kupplung von Boc-Cys^Trt-OH und Boc-iCys^Trt-OH^[65,281]: Nach dem Abspalten der N-terminalen Schutzgruppe des zuletzt gekuppelten Monomers wurde das Harz 3× 30 min und 1× über Nacht in einer Lösung aus 4 Äquiv. des geschützten (Iso)cysteinderivats (bezüglich der Erstbeladung des eingesetzten Harzes, Endkonzentration: ca. 0.1 M), 4 Äquiv.

PyBOP und 12 Äquiv. NMM in DMF geschüttelt und gewaschen (5× DMF, je 1 mL).

Kupplung von FAM-OH und TMR-OH: Die Umsetzung erfolgte nach dem Aufbau der Sequenzen am polymeren Träger. FAM-OH: Zum Abspalten der Alloc-Schutzgruppe an den modifizierten PNA-Monomeren 102^[243] oder 103^[243] wurde das Harz (5 µmol, bezogen auf die Erstbeladung des eingesetzten Harzes) zunächst gewaschen (5× entgastes und anschließend mit Argon gesättigtes DCM, je 1 mL). Nach der Zugabe der Allylfängerlösung

Argon gesättigtem DCM) wurde auch die Abspaltlösung (1 Äquiv. Pd(PPh3)4 in 300 µL entgastem und anschließend mit Argon gesättigtem DCM) unter einer Argon-Schutzgasatmosphäre zum Harz gegeben und 30 min geschüttelt. Nach dem Waschen (5×

DCM, 5× DMF, 5× entgastes und anschließend mit Argon gesättigtes DCM, je 1 mL), wurde der Vorgang wiederholt und nochmals gewaschen (5× DCM, 5× DMF, 2× Dioxan/Wasser (9:1, v:v), 2× Methanol, 15× DMF, je 1 mL). Das Harz wurde anschließend 2× 1 h in einer Lösung aus 4 Äquiv. 6-Carboxyfluorescein (FAM-OH, Endkonzentration: ca. 0.1 M), 4 Äquiv. PyBOP und 10 Äquiv. NMM in DMF geschüttelt und gewaschen (10× DMF, 10×

DCM, je 1 mL). TMR-OH: Zum Abspalten der Fmoc-Schutzgruppe an den modifizierten PNA-Monomeren 110 oder 111 wurde das Harz gewaschen (5× DMF, je 1 mL) und 4× 5 min in Piperidin/DMF (1:4, v:v, je 1 mL) geschüttelt. Nach dem Waschen (15× DMF, je 1 mL) wurde das Harz 2× 1 h in einer Lösung aus 4 Äquiv. 6-Carboxytetramethylrhodamin (TMR-OH, bezogen auf die Erstbeladung des eingesetzten Harzes, Endkonzentration: ca. 0.1 M), 4 Äquiv. PyBOP und 10 Äquiv. NMM in DMF geschüttelt und gewaschen (10× DMF, 10×

DCM, je 1 mL).

Acetylierung des N-Terminus: Nach dem Abspalten der N-terminalen Schutzgruppe des zuletzt gekuppelten Monomers wurde das Harz 2× 5 min in 1 mL DMF/2,6-Lutidin/Essig-säureanhydrid (89:6:5, v:v:v) geschüttelt und gewaschen (10× DMF, 10× DCM, je 1 mL).

Halogenacetylierung des N-Terminus: Nach dem Abspalten der N-terminalen Schutzgruppe des zuletzt gekuppelten Monomers wurde das Harz 2× 30 min in einer Lösung aus 10 Äquiv.

Halogenessigsäure (bezogen auf die Erstbeladung des eingesetzten Harzes, Endkonzentration:

ca. 0.1 M), 10 Äquiv. PyBOP und 12 Äquiv. NMM geschüttelt und gewaschen (10× DMF, 10× DCM, je 1 mL).

Synthese von Verknüpfungsprodukten: Alle Arbeiten wurden unter einem Strom von Argon durchgeführt. Aliquote (5−30 nmol) der entsprechenden reaktiven PNA-Konjugate wurden gefriergetrocknet und separat in entgastem und anschließend mit Argon gesättigtem Puffer (100 mM NaH2PO4, 10 mM MESNa, 30 vol% DMF, 20 vol% Acetonitril, pH 7.4, Endkonzentration der Reaktanden: 200 µM) gelöst bzw. suspendiert. Nach 1 h wurden beide Lösungen vereint und 19 h−3 d bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Zugabe von 10 vol%

TFA wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in entgastem und anschließend mit Argon gesättigtem TCEP-Puffer (100 mM NaH2PO4, 2 mM TCEP, pH 7.4) aufgenommen und 1 h geschüttelt. Anschließend wurde die Lösung mit

1 vol% TFA versetzt und mittels analytischer HPLC gereinigt (Gradient 3). Die Ausbeuten wurden UV/Vis-spektroskopisch über die Absorption des FAM-Fluorophors bestimmt (Kapitel 6.2).

Synthese von PNA-MESNA-Thioestern durch Umthioesterung: Alle Arbeiten wurden unter einem Strom von Argon durchgeführt. Die jeweiligen PNA-Mercaptopropionsäure-thioester wurden in entgastem und anschließend mit Argon gesättigtem Puffer (100 mM NaH2PO4, 100 mM MESNa, 20 vol% Acetonitril, pH 7.4) aufgenommen, bis sie vollständig gelöst waren. Nach 1 h (PNA-Glycylthioester) oder 3 h (PNA-Alanylthioester) wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 vol% TFA beendet, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand nach Aufnahme in Wasser oder gegebenenfalls in Wasser/

Acetonitril/TFA (max. 50 vol% Acetonitril und 1 vol% TFA) mittels semi-präparativer HPLC gereinigt.