Detektion des Wildtyptemplats

Da die Ala-Cys-Verknüpfung gegenüber der Ala-iCys-Ligation die größere Einzelbasen-spezifität besaß, wurde sie für weitere Untersuchungen ausgewählt. Um auch die Wildtyp-variante des B-Raf-Gensegments detektieren zu können, erfolgte die Synthese der TMR-markierten Cysteinyl-PNA 155. Diese bindet spezifisch an das Wildtyptemplat Raf-wt2 und bildet mit Raf-mt2 eine Einzelbasenfehlpaarung aus. Die Umsetzung von 155 mit dem

PNA-Alanylthioester 136 unter den Bedingungen der templatgesteuerten NCL lieferte in Gegenwart des komplementären Templats Raf-wt2 nach 1 h einen 3.4-fachen Signalanstieg (Abbildung 39). Das fehlpaarende Templat Raf-mt2 bewirkte in der gleichen Zeit nur einen 1.4-fachen Anstieg des FRET-Signals, während die Hintergrundreaktion kaum zu detektieren

Abbildung 39: Relative Änderung des FRET-Signals bei der Umsetzung des PNA-Ala-Thioesters 136 mit der wildtypspezifischen Cys-PNA 155 in Gegenwart des komplementären Templats Raf-wt2, des einzelbasenfehl-paarenden Templats Raf-mt2 sowie ohne Templat (1 µM Sonden und DNA-Templat, 10 mM NaH2PO4, 10 mM MESNa, 150 mM NaCl, pH 7.4, T = 50 °C, _ex. = 470 nm, R = (CH2)2SO3H).

war. Die Einzelbasenspezifität der Verknüpfung war mit S = 68 mehr als fünfmal größer als die entsprechende Reaktion von 136 mit der mutantenspezifischen Sonde 145 (S = 14). Eine Schmelzkurvenanalyse der perfekt gepaarten und einzelbasenfehlgepaarten Duplexe 155•Raf-wt2 und 155•Raf-mt2 ergab einen Unterschied in den Schmelztemperaturen von lediglich 1 °C (TM = 46 °C bzw. 45 °C). Die über Denaturierungsexperimente ermittelten Templataffinitäten konnten daher nicht für eine Erklärung der gesteigerten Einzelbasen-spezifität herangezogen werden.

4.2.16 Kompatibilität der PCR mit dem Thioladditiv MESNa und den reaktiven PNA-Konjugaten

Mit dem PNA-Alanylthioester 136 und den Cysteinyl-PNAs 145 und 155 standen zwei Sätze genotypspezifischer Sonden für den Einsatz in der PCR zur Verfügung. Um dem Szenario einer Genotypisierung von DNA aus menschlichen Gewebeproben über eine templatgesteuerte Verknüpfungsreaktion möglichst nahe zu kommen, wurde humane, genomische DNA als Ausgangsmaterial für die PCR ausgewählt. Die Wildtyp-DNA (WT-HGD) wurde aus menschlichem Blut gewonnen und von Roche bezogen. Die einzelbasen-mutierte DNA (MT-MEL) stammte aus der menschlichen Melanomzelllinie SK-MEL-28, die homzygot für die V600E-Mutation des B-Raf-Gens ist, und wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben. Zuerst galt es, entsprechende Primer zu finden, welche die Zielsequenz mit den Anbindungsstellen der PNA-Sonden vervielfältigen und dabei für eine Anlagerungs- bzw. Reaktionstemperatur von 50 °C geeignet sind. Kumar et al.

verwendeten einen Primersatz, der bei einer Anlagerungstemperatur von 52 °C das gewünschte Amplicon aus dem Exon 15 des B-Raf-Gens lieferte.^[236] Durch Kürzung um jeweils ein Nukleotid ergeben sich die Sequenzen des Vorwärtsprimers 1 (VP1) und des Rückwärtsprimers 1 (RP1), die ein 208 Basenpaare langes Amplicon vervielfältigen (Abbildung 40). Außerdem wurde ein zweiter Vorwärtsprimer (VP2) gewählt, der näher an

Abbildung 40: a) Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärtsprimer VP1, VP2 und RP1. b) Ausschnitt aus dem humanen B-Raf-Gen. Die Position der V600E(T1799A)-Einzelbasenmutation (X) befindet sich im Exon 15 (in eckigen Klammern eingefasst). Die Anbindungsstellen der Cys-PNAs 145 bzw. 155 (blau), des

PNA-Ala-der Anbindungsstelle PNA-Ala-der Cysteinyl-PNA hybridisiert und so mit RP1 ein kürzeres, 108 Basenpaare langes Amplicon erzeugt.

Zuerst wurde getestet, ob die PCR die Anwesenheit des Thioladditivs MESNa toleriert.

Dieses wird benötigt, um als Reduktionsmittel die Bildung von Disulfiden der Cysteinyl-PNAs zu verhindern. Das Temperaturprogramm der PCR begann mit der Denaturierung des doppelsträngigen Templats bei 95 °C (10 s), gefolgt von der Anlagerung der Primer bei 50 °C (20 s) und deren Elongation durch die Polymerase bei 72 °C (20 s). Diese drei Schritte wurden jeweils vierzigmal wiederholt. Der zugesetzte Interkalatorfarbstoff SYBR^® Gold sollte durch einen Fluoreszenzanstieg die Bildung der doppelsträngigen PCR-Produkte anzeigen. Die PCR wurde mit 10 ng des Wildtyptemplats WT-HGD und mit unterschiedlichen Konzentrationen an MESNa angesetzt. Zur Kontrolle erfolgte jedes Experiment auch in Abwesenheit des Templats (no template control, NTC). Der im Anlagerungsschritt eines jeden PCR-Zyklus detektierte Anstieg der SYBR^® Gold-Emission bei 530 nm wurde durch die Anwesenheit von 1 mM oder 10 mM des Thioladditivs nicht beeinflusst (Abbildung 41a).

Zudem bestätigte eine gelelektrophoretische Analyse der PCR-Lösungen nach der Ampli-fizierung die Bildung der erwarteten Amplicons in den templatenthaltenden Ansätzen (Abbildung 41b). Die PCR war demnach mit den getesteten MESNa-Konzentrationen kompatibel. Im Falle der NTCs lag in den Gelen keine dem Amplicon entsprechende Bande

Abbildung 41: a) SYBR^® Gold-Fluoreszenz während der PCR in Gegenwart von verschiedenen MESNa-Konzentrationen. b) Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Lösungen aus a). c) Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Lösungen aus Amplifizierungsreaktionen in Gegenwart von 10 mM MESNa und verschiedenen Konzentrationen der reaktiven PNA-Konjugate 136 + 155 (PCR-Bedingungen: 100 nM VP1, 100 nM RP1, 200 μM dNTPs, 2.5 mM MgCl2, 10 mM TRIS, pH 8.5 (bei 25 °C), 1 u Taq-Polymerase, ggf. 10 ng Templat WT-HGD, PCR-Protokoll: 10 s 95 °C, 20 s 50 °C (Detektion: _ex. = 490 nm, _em. = 530 nm), 20 s 72 °C, Gel: 8%

Polyacrylamid, Anfärbung: SYBR^® Gold, bp = Basenpaare).

vor. Hier wurden jedoch Produkte mit einer Länge < 50 Basenpaare detektiert, welche ebenfalls zu einem Anstieg der SYBR^® Gold-Fluoreszenz in späteren PCR-Zyklen führten.

Diese wurden sogenannten Primerdimeren^[247] zugeordnet, die aufgrund der relativ niedrigen Anlagerungstemperatur gebildet werden können und ungefähr die doppelte Länge der einzelnen Primer aufweisen. Sie entstehen durch die Hybridisierung zweier Primer an deren jeweiligen 3′-Enden und die anschließende Verlängerung durch die Polymerase. Die bevorzugte Bildung der Primerdimere in Abwesenheit des Templats kann durch die freie Verfügbarkeit der einzelnen Primer erklärt werden, die hier nicht in die Templatamplifizierung involviert waren. In den Fluoreszenzmessungen wurde der Nachteil einer unspezifischen Echtzeitdetektion der PCR-Produkte deutlich. Der Interkalatorfarbstoff ist nicht in der Lage, zwischen dem Amplicon und den Primerdimeren zu unterscheiden.

Um auszuschließen, dass die reaktiven PNA-Konjugate eine Inhibierung der PCR bewirken, wurde eine weitere Amplifizierung in Gegenwart von 10 mM MESNa und verschiedenen Konzentrationen des FAM-markierten PNA-Alanylthioesters 136 und der TMR-markierte Cysteinyl-PNA 155 durchgeführt. Auch hier belegte die gelelektrophoretische Analyse die effiziente Amplifizierung des Amplicons bei Sondenkonzentrationen von bis zu 1 µM (Abbildung 41c).

4.2.17 Detektion der templatgesteuerten Verknüpfungsreaktion während der PCR