3.4 Mischfutter und Fütterung
3.4.3 Mischfutteranalysen
3.4.3.1 Weender Analyse
Zur Bestimmung der Rohnährstoffgehalte diente die Weender Futtermittelanalyse.
Material und Methoden
- 47 - Trockensubstanz (1. TS)
Zunächst wurden Aluschalen, deren Trockenmasse zuvor ermittelt wurde, mit etwa 50 - 100 g des ungemahlenen Probenmaterials (uS) befüllt und die Masse der Einwaage mit einer Oberschalenwaage (1C4201S, Fa. Sartorius, Göttingen; Wiegegenauigkeit: 0,01 g) erfasst.
Über Nacht erfolgte dann die Trocknung der Probe bei 103 °C im Trockenschrank (s. Tabelle 50). Zum Abkühlen wurden die Proben bis zum Erreichen der Raumtemperatur in Exsikkatoren verbracht, bevor die Aluschalen inklusive des Probenmaterials wiederum gewogen und die Auswaage berechnet wurde (3LQBRCCKA ;=> = 3LFQBSOCFA,KATüFFE ;=> – 3LFQBSOCFA,FAAG ;=>).
Der Trockensubstanzgehalt wurde dann mit folgender Formel berechnet:
WX ;%> =3LQBRCCKA ;=>
3YIMRCCKA ;=> ∗ 100 bzw.
WX ;=/<=> =3LQBRCCKA ;=>
3YIMRCCKA ;=> ∗ 1000
Trockensubstanz (2. TS)
Nach dem Vermahlen des Untersuchungsguts erfolgte erneut eine Bestimmung des TS-Gehalts nach oben genanntem Prinzip. Die Einwaage betrug hier etwa 3 g und erfolgte in einen bis zur Massekonstanz getrockneten, im Exsikkator abgekühlten und daraufhin auf einer Analysenwaage (s. Tabelle 50) gewogenen Tiegel. Die 2. TS wurde als Größe zur Umrechnung der im gemahlenen Material analysierten Nähr- und Mineralstoffgehalte auf die Gehalte je kg TS bzw. uS benötigt.
Rohasche
Die zur Bestimmung der 2. TS genutzten Tiegel inklusive des jeweiligen getrockneten und ausgewogenen Probenmaterials wurden für sieben Stunden im Muffelofen (s. Tabelle 50;
Aufheizzeit: 4,5 h) bei 600 °C einer Veraschung unterzogen und anschließend zum Abkühlen in Exsikkatoren überführt. Nach Erreichen der Raumtemperatur erfolgte die Auswaage wiederum auf einer Analysenwaage (s. Tabelle 50). Der Rohaschegehalt wurde dann analog zum Trockensubstanzgehalt berechnet.
- 48 - Rohprotein
Die Bestimmung des Rohprotein-Gehalts (Rp) erfolgte rechnerisch nach Analyse des Stickstoffgehalts mittels Analysator (Vario Max CNS, Fa. Elementar Analysensysteme GmbH, Langenselbold) nach der DUMAS-Verbrennungsmethode. Hierfür wurden zunächst 0,1 - 0,3 g Probenmaterial in einen Keramiktiegel eingewogen und dann im Analysator einer Hochtemperaturverbrennung bei ca. 1.140 °C unterzogen. Die dabei entstandene Menge molekularen Stickstoffs wurde mithilfe eines Wärmeleitfähigkeitsdetektors und nach vorheriger Kalibrierung durch die Software des Gerätes bestimmt.
Da Rohprotein im MF zu etwa 16 % aus Stickstoff besteht, wurde der Rp-Gehalt anhand des ermittelten N-Gehalts mit folgender Formel kalkuliert:
\] ;= <=⁄ WX> = _ ;= <= WX⁄ > ∗ 6,25 Rohfett
Vor der Fettextraktion und -quantifizierung erfolgte ein Kochen des Probenmaterials in Salzsäure. Dazu wurden jeweils etwa 3 g des Analysenguts auf einer Analysenwaage (s.
Tabelle 50) in ein 600 ml-Becherglas eingewogen und nach Zugabe einiger Siedesteine mit 140 ml Wasser sowie 60 ml 30 %-iger Salzsäure aufgefüllt.
Das Gemisch wurde dann, mit einem Uhrglas bedeckt, auf einer Heizplatte erhitzt und für 30 Minuten gekocht. Während des Kochvorganges wurde wiederholt heißes Wasser hinzugefügt, um das Volumen von etwa 200 ml konstant zu halten.
Im Anschluss wurde das Uhrglas mit heißem Wasser abgespült und die auf ein Volumen von 300 ml aufgefüllte Probe restlos durch einen angefeuchteten Faltenfilter (Faltenfilter MN 615, Ø 185 mm, Fa. Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren) filtriert. Nach mehrfachem Spülen des Filters mit Leitungswasser wurde dieser über Nacht bei 80 °C im Trockenschrank (s.
Tabelle 50) getrocknet.
Die sich anschließende 6-stündige Fettextraktion aus dem nach Säureaufschluss gewonnenen Rückstand im Filter erfolgte am folgenden Tag mit Petrolether im Soxhlet-Apparat.
Das zuvor aufgeschlossene Probenmaterial inklusive des Filterpapiers wurde dazu in eine Extraktionshülse gebracht und in den Soxhlet-Aufsatz gegeben. Als Extraktionsmittel wurden etwa 200 ml Petrolether in einen zuvor mit einigen Siedesteinen bestückten und für mindestens eine Stunde bei 103 °C im Trockenschrank getrockneten, im Exsikkator
Material und Methoden
- 49 -
abgekühlten und ausgewogenen 250 ml-Stehkolben gefüllt und dieser an den Soxhlet-Apparat angeschlossen.
Im Anschluss an die Extraktion und Entfernung des überschüssigen Petrolethers aus dem Siphon erfolgte die Verdampfung des Petrolethers aus dem Stehkolben mit einem Rotationsverdampfer (Hei-VAP Value Digital, Fa. Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach) bei 500 mbar in einem 80 °C warmen Wasserbad.
Nach Trocknung des Stehkolbens bei 80 °C über Nacht im Trockenschrank (s. Tabelle 50) und anschließender Abkühlung im Exsikkator wurde die Masse des extrahierten Fetts auf einer Analysenwaage (s. Tabelle 50) ermittelt (3`AEE ;=> =Dabccdefgbh ihdf.abcc ;K>
Dabccdefgbh,fbbj ;K> ).
Der Rohfettgehalt wurde dann mit folgender Formel berechnet:
\k7 ;= <=⁄ > = 3`AEE ;=>
3YIMRCCKA ;=> ∗ 1000
Rohfaser
Die Untersuchung der Proben auf den Rohfasergehalt erfolgte durch Bestimmung des in verdünnter Schwefelsäure und in verdünnter Natronlauge unlöslichen sowie fett- und aschefreien Anteils.
Dazu wurde 1 g des Analysengutes in einem Glasfiltertiegel zunächst mit ca. 150 ml 1,25 %-iger Schwefelsäure versetzt und in einem Rohfaserbestimmungsgerät (Fibertec™ 2010 Hot Extractor, Fa. Foss GmbH, Hamburg) 30 Minuten lang gekocht. Nach Entfernung der Säure schloss sich ein entsprechender Kochvorgang mit 1,25 %-iger Natronlauge an. Mit heißem Wasser wurde das verbliebene, in verdünnter Säure bzw. Lauge unlösliche Material gespült, über Nacht im Trockenschrank (s. Tabelle 50) bei 103 °C getrocknet und anschließend bei 500 °C im Muffelofen (s. Tabelle 50, Aufheizzeit: 1 h) verascht. Nach Auswaage des veraschten Materials konnte der aschefreie, in verdünnter Säure und Lauge unlösliche Anteil der Probe wie folgt berechnet werden:
\kl ;= <=> =m3HIAKAF MCSO HGnSJMAM ;=> o 3HIAKAF MCSO pAGCBSOQMK ;=>q 3YIMRCCKA ;=>
r ∗ 1000
N-freie Extraktstoffe (NfE)
Der Gehalt an N-freien Extraktstoffen wurde rechnerisch mit folgender Formel bestimmt:
_ks = WX o (\l t \] t \k7 t \kl)
- 50 - 3.4.3.2 Kohlenhydrate
In den Mischfuttermitteln wurden auch die Stärke- und Zuckergehalte bestimmt. Das Vorgehen wird im Folgenden beschrieben.
Stärke
Die Bestimmung des Stärkegehalts erfolgte mittels polarimetrischer Messung. Neben der Messung zweier Hauptwerte erfolgte die Messung eines Blindwertes nach Entfernung der originär in der Probe enthaltenen Stärke.
In einen 100 ml-Messkolben wurden 2,5 g des Probenmaterials zur Ermittlung der Hauptwerte eingewogen und durch Schütteln mit 50 ml 0,31 molarer HCl vermischt.
Daraufhin wurde die Probe zwecks Aufschluss für 15 Minuten in ein siedendes Wasserbad gegeben. Nach Herausnahme aus dem Wasserbad wurden den Proben etwa 30 ml kaltes A. dest. hinzugefügt. Parallel erfolgte zur Bestimmung des Blindwerts die Einwaage von 5 g Analysengut in einen 100 ml Messkolben, dem im Folgenden ca. 80 ml 40 %-iger Ethanol hinzugefügt wurden. Der Ansatz für den Blindwert wurde für eine Stunde stehen gelassen und danach wiederum mit 40 %-igem Ethanol auf ein Volumen von 100 ml aufgefüllt, geschüttelt und filtriert (Faltenfilter MN 615, Ø 185 mm, Fa. Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren).
Von dem so gewonnenen Filtrat wurden 50 ml in einen 100 ml-Erlenmeyerkolben überführt und mit 2,1 ml einer 25 %-igen HCl versetzt. Im Anschluss erfolgte ein 15-minütiges Kochen des an einen Rückflusskühler angeschlossenen Erlenmeyerkolbens in einem siedenden Wasserbad. Mit etwas destilliertem Wasser wurde das Analysengut dann in einen 100 ml-Kolben überspült. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden sowohl dem Ansatz des Haupt- als auch des Blindwertes je 5 ml CARREZ-Reagenz I und II durch jeweils 1-minütiges Schütteln hinzugemischt, bevor das Probenvolumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt und über einen Faltenfilter (Faltenfilter MN 615, Ø 185 mm, Fa. Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren) gegeben wurde.
Die so gewonnenen Lösungen wurden im Anschluss unmittelbar der polarimetrischen Messung (Polatronic E, Fa. Schmidt und Haensch, Berlin) zugeführt.
Der Stärkegehalt wurde anschließend wie folgt berechnet:
X5ä8<7 ;= <=⁄ > = mvlw]5x785 o y64z{x785 ∗ 10,871q ∗ 10
1 Faktor für Stärkegemische in MF
Material und Methoden
- 51 - Zucker
Die Bestimmung des Zuckergehalts erfolgte mit der Methode nach Luff-Schoorl in Anlehnung an das von SCHOORL (1929) beschriebene Vorgehen. Es wurden 2,5 g Probe in einen 250 ml-Messkolben in etwa 200 ml 40 %-igen Ethanol durch einstündiges Schütteln in Lösung gebracht. Anschließend wurden jeweils 5 ml CARREZ-Reagenz I bzw. II hinzugefügt und jeweils durch erneutes, einminütiges Schütteln eingemischt.
Danach folgten das Auffüllen des Probenvolumens auf 250 ml mit 40 %-igem Ethanol und die Filtration des Gemisches durch einen Faltenfilter (Faltenfilter MN 615, Ø 185 mm, Fa.
Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren) in einen 250 ml-Messzylinder. 200 ml des Filtrats wurden dann in ein Becherglas überführt und nach Hinzufügen mehrerer Siedesteine auf einer Heizplatte eingedampft, bis sich das Volumen auf unter 100 ml reduziert hatte. Die Lösung wurde dann in 100 ml-Messkolben überführt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Anschließend wurden 50 ml der so gewonnenen Lösung wiederum in einen 100 ml-Messkolben überführt. Daraufhin wurden einige Tropfen Methylorange zugegeben. Bis zum Auftreten eines deutlichen Farbumschlags ins Rötliche wurde dann 4 molare Salzsäure hinzugefügt und der Lösung dann 15 ml 0,1 molare HCl zugesetzt, bevor der Messkolben für 30 Minuten in ein siedendes Wasserbad gegeben wurde.
Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden der Lösung 15 ml 0,1 molare NaOH hinzugefügt und das Probenvolumen mit A. dest auf 100 ml aufgefüllt. In einem Erlenmeyerkolben wurden anschließend 25 ml der Probenlösung mit der gleichen Menge Reagenz nach Luff-Schoorl versetzt und einige Siedesteine hinzugegeben. Nach Anschluss an einen Rückflusskühler erfolgten die Erhitzung und ein zehnminütiges Kochen der Lösung über einer Gasflamme.
Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10 ml 30 %-iger Kaliumjodidlösung sowie 25 ml 6 molarer HCl versetzt. Zur Herstellung einer Lösung zur Bestimmung des Blindwertes wurde ein weiterer Ansatz mit 25 ml destilliertem Wasser anstelle der Probenlösung hergestellt.
Abschließend erfolgten die Zugabe einer Stärkelösung und die Titration der Lösung mittels 0,1 molarer Na2S2O3. Aus entsprechenden Tabellen1 konnte mit Hilfe der Differenz zwischen
1 Vgl. VDLUFA Methodenbuch Band III, 7.1.1
- 52 -
den Ergebnissen der Titrationen von Proben- und Blindwert-Lösung der Zuckergehalt abgelesen werden.
3.4.3.3 Energiegehalt
Die Energiegehalte der MF-Varianten wurden durch Kalkulation gemäß den Vorgaben der gültigen Futtermittelverordnung1 anhand der analysierten Nährstoffgehalte (je kg TS) mit folgender Formel ermittelt:
ME ;:| <= WX⁄ >
= 0,021503 \] t 0,032497 \k7 t 0,016309 X5ä8<7 t 0,014701 }\ o 0,021071 \kl Der organische Rest ist dabei wie folgt definiert:
}\ = }X o (\] t \k7 t X5ä8<7 t \kl)
3.4.3.4 Mengen- und Spurenelemente
Die Messungen der Mengen- und Spurenelementgehalte erfolgten mittels Atomabsorptionsspektrometrie (AAS; Solaar AA Spectrometer M Series 602222, Fa. Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) bzw. Photometrie nach Mikrowellenveraschung2. Zunächst wurden 0,5 g des gemahlenen Probenmaterials in ein Polytetrafluorethylen-Mikrowellengefäß eingewogen und mit 7 ml 65 %-iger Salpetersäure, 3 ml einer 30 %-igen Wasserstoffperoxid-Lösung sowie 3 ml Reinstwasser ergänzt.
Nachfolgend wurden die Proben für 29 Minuten in der Mikrowelle (Ethos.lab, Fa. MLS GmbH, Leutkirch) verascht und auf Raumtemperatur abgekühlt. Mit Reinstwasser erfolgte das vollständige Überspülen des Materials durch einen Schwarzbandfilter (Rundfilter, aschefrei, Ø 90 mm; Fa. IDL GmbH & Co. KG, Nidderau) in einen 50 ml-Messkolben. Im Anschluss wurde das Probenvolumen mit Reinstwasser auf 50 ml aufgefüllt und die Lösung nach kräftigem Schütteln in verschließbare Kunststoff-Probenflaschen überführt.
Calcium
Die Probenlösung wurde mit 0,5 %-iger Lanthanchlorid-Lösung verdünnt, wobei die gewählte Verdünnung in Abhängigkeit von dem zu erwartenden Wert gewählt wurde (1:100 bzw.
1:1000). Im Anschluss erfolgte die Messung mittels Atomabsorptionsspektrometer (Solaar AA Spectrometer M Series 602222, Fa. Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).
1 BGBl. I 2016, S. 2026
2 nur Selen: Nassveraschung
Material und Methoden
- 53 - Phosphor
Die Bestimmung des P-Gehalts in den eingesetzten Futtermitteln erfolgte photometrisch nach der Methode von GERICKE und KURMIES (1952).
In einem ersten Schritt wurde ein Gemisch aus drei verschiedenen Lösungen hergestellt. Für die erste Lösung wurden 65 %-ige Salpetersäure und Reinstwasser im Verhältnis 1:3 gemischt. Zu Herstellung der zweiten Lösung wurden zunächst 500 ml Reinstwasser zum Kochen gebracht und 2,5 g NH4VO3 darin gelöst. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 20 ml einer 65 %-igen Salpetersäure hinzugegeben. Die dritte Lösung bestand aus 50 g (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O, gelöst in einem Liter Reinstwasser. Alle drei Lösungen wurden durch kräftiges Schütteln zu einer Reagenzmischung („Phosphorreagenz“) vermengt.
Je Probe wurden mit Hilfe eines Dispensers 10 ml dieses Phosphorreagenz in einem 50 ml-Messkolben vorgelegt. Drei weitere ml-Messkolben wurden auf die gleiche Weise vorbereitet und dienten der Herstellung zweier Standardlösungen sowie einer Lösung zur Bestimmung des Nullwertes. Die P-Stammlösung bestand aus 4,3963 g KH2PO4, gelöst in einem Liter Reinstwasser. In den Kolben des ersten Standards wurden mit einer Kolbenhubpipette (Fa.
Eppendorf AG, Hamburg) 25 µl, in den Kolben des zweiten Standards 100 µl der Stammlösung hinzugegeben. Die sich ergebenden P-Gehalte der beiden Lösungen betrugen 0,5 bzw. 2 mg/l. In den Probenansatz wurde dann je nach zu erwartendem P-Gehalt der Probe in 50 - 1000 µl-Schritten eine solche Menge der Aschelösung hinzugegeben, dass die Gelbfärbung der Probelösung zwischen denjenigen der beiden Standards lag. Das Probenvolumen wurde im Anschluss mit Reinstwasser auf 50 ml aufgefüllt und der Kolben nach Verschließen mit einem Stopfen kräftig geschüttelt. Auch die Standardlösungen sowie der Blindwertansatz wurden daraufhin mit Reinstwasser aufgefüllt und geschüttelt. Nachdem die Lösungen mindestens 30 Minuten lang stehen gelassen wurden, erfolgte die photometrische Messung (UV-1602, Fa. Shimadzu Europa GmbH, Duisburg) der Proben bei einer Wellenlänge von 365 nm.
löslicher Phosphor
Die Gehalte an löslichem Phosphor wurden nach fünf verschiedenen Aufschlussverfahren, wie in der Dissertation von KIRCHNER (2015) beschrieben, analysiert.
Für die ersten beiden Ansätze („ohne Inkubation“) wurde ein Aliquot von 3 g in ein Reagenzröhrchen eingewogen und mit 19,5 ml Reinstwasser bzw. 0,4 %-iger Salzsäure
- 54 -
versetzt, bevor das Röhrchen mit einem Stopfen verschlossen wurde. Anschließend wurde die so hergestellte Suspension mit einem Vortexmischer eine Minute lang durchmischt und danach zentrifugiert (3 Min bei 3000 U/Min; Heraeus Megafuge 1.0, Fa. Heraeus Holding GmbH, Hanau). Von dem gewonnenen Überstand wurden 3 ml entnommen und nach Mikrowellenveraschung der P-Bestimmung zugeführt (s. o.).
Für weitere zwei Ansätze („mit Inkubation“) wurde wie zuvor beschrieben verfahren, mit der Ausnahme, dass das Probenmaterial vor der Zentrifugation (10 Min bei 3000 U/Min; Heraeus Megafuge 1.0, Fa. Heraeus Holding GmbH, Hanau) 90 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren inkubiert wurde.
Für den fünften Ansatz („mit Inkubation, Phytase inaktiviert“) wurden 3 g Probe für 30 - 35 Minuten in einem verschlossenen Probenfläschchen bei etwa 103 °C im Trockenschrank inkubiert. Anschließend wurde die abgekühlte Probe mit 19,5 ml Reinstwasser versetzt. Das weitere Vorgehen entsprach dann dem zuvor für die Ansätze „mit Inkubation“ beschriebenen.
Natrium
Vor Durchführung der Messung mittels AAS (Solaar AA Spectrometer M Series 602222, Fa.
Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) wurden die Proben im Verhältnis 1:10, 1:100 oder 1:1000 mit einer Caesiumchlorid-Aluminiumnitrat-Pufferlösung nach SCHUHKNECHT und SCHINKEL (1963) verdünnt.
Magnesium
Das Vorgehen zur Bestimmung der Mg-Gehalte entsprach jenem zur Analyse der Ca-Gehalte.
Kalium
Die Vorbereitung der Proben erfolgte wie bei Natrium beschrieben. Anschließend wurde der K-Gehalt mittels Atomabsorptionsspektrometrie (Solaar AA Spectrometer M Series 602222, Fa. Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) bestimmt.
Chlorid
Die Cl--Bestimmung erfolgte nach dem Prinzip der coulometrischen Titration. Dafür wurden zunächst, je nach Quellvermögen des Materials, 5 g der Probe in einen 50 ml-Messkolben eingewogen und etwa 30 - 40 ml destilliertes Wasser hinzugegeben. Nach halbstündigem Schütteln des Ansatzes auf einer Schüttelplatte wurde das Volumen wiederum mit A. dest auf
Material und Methoden
- 55 -
50 ml aufgefüllt und erneut kräftig geschüttelt. Der Suspension wurde anschließend ein Aliquot entnommen und dieses 15 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert (Heraeus Megafuge 1.0, Fa. Heraeus, Hanau). Der so entstandene klare Überstand diente nachfolgend als Probenlösung zur Untersuchung im Chloride Analyzer 925 (Fa. Corning Inc., Corning, USA).
Kupfer, Zink, Eisen, Mangan
Mit Ausnahme des Se-Gehalts wurden die Gehalte an Spurenelementen im MF nach Mikrowellenveraschung atomabsorptionsspektrometrisch gemessen. Zuvor wurde bei Bedarf je nach dem zu erwartenden Gehalt eine Verdünnung mit Reinstwasser vorgenommen (1:10, 1:100 oder 1:1000).
Selen
Die Selenbestimmung erfolgte im Anschluss an eine Nassveraschung. Zu diesem Zweck wurde 1 g des Materials in einen 100 ml-Kjeldahlkolben eingewogen und 15 ml eines Veraschungsgemisches, hergestellt aus 70 %-iger Perchlorsäure und 65 %-iger Salpetersäure im Verhältnis 1:4, hinzugegeben.
Durch vorsichtiges Erwärmen wurden die anorganischen Bestandteile in Lösung gebracht, bis ein Farbumschlag der Lösung das Ende des Veraschungsvorganges anzeigte und die verbliebene Säure durch stärkeres Erhitzen abgeraucht werden konnte. Zu der nahezu trockenen, abgekühlten Probe wurden dann 5 ml einer verdünnten Salzsäure (c = 7,5 %) hinzugegeben und anschließend verdampft. Dieser Vorgang wurde noch einmal wiederholt, bevor die Probe nach Abkühlung mit 10 ml 18,5 %-iger Salzsäure versetzt und für eine halbe Stunde in einem siedenden Wasserbad inkubiert wurde. Die so entstandene Lösung wurde gefiltert (Rundfilter, aschefrei, Ø 90 mm; Fa. IDL GmbH & Co. KG, Nidderau), mit A. dest.
in einen 25 ml Messkolben überspült und das Volumen mit A. dest. auf 25 ml aufgefüllt. Die Probenlösung wurde dann der Messung mittels eines an ein Atomabsorptionsspektrometer angeschlossenen Hybridsystems zugeführt.
3.4.3.5 Aminosäuren (AS)
Die Bestimmung der AS-Gehalte in den eingesetzten Futtermitteln erfolgte mittels Ionenaustauschchromatographie in einem AS-Analysator (LC 3000 Amino Acid Analyzer,
- 56 -
Fa. Eppendorf Biotronik, Maintal) in hydrolysiertem Probenmaterial. Zur Analyse von Methionin und Cystein ging der Hydrolyse eine Oxidation des Probenmaterials voraus.
Methionin und Cystein
Es wurden 0,2 g der Probe in einem Aufschlussgerät mit 5 ml Perameisensäure (CH2O2, c = 88 % und H2O2, c = 30 % im Verhältnis 9:1) als Oxidationsmittel versetzt und mit Hilfe eines Magnetrührers im Eisbad 30 Minuten lang vermischt. Anschließend wurde das Gemisch über Nacht für 16 h im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt. Zur Beendigung der Oxidation wurden 0,84 g Natriumdisulfit hinzugegeben und die Probe 30 Minuten gerührt.
Anschließend erfolgte die Zugabe von 50 ml Salzsäure (c = 6 mol/l mit 0,1 % Phenol) zur Lösung. Die Probe wurde dann über Nacht acht Stunden lang mittels Inkubation in einem Aluminium-Heizblock (Kjeldatherm®, Fa. C. Gerhardt GmbH & Co. KG, Königswinter) bei 110 °C aufgeschlossen. Nach Abkühlung im Wasserbad erfolgte die Filtration der Lösung unter Zuhilfenahme einer Wasserstrahlpumpe durch einen Membranfilter (OE 66, Durchmesser: 47 mm, 0,2 µm, Fa. GE Healthcare) in einen 1000 ml-Rundkolben. Mit destilliertem Wasser wurde das Probenmaterial vollständig überspült. An einem Rotationsverdampfer (Hei-VAP Value Digital, Fa. Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach) wurde die Flüssigkeit im Anschluss bei 20 mbar in einem max. 60 °C warmen Wasserbad verdampft. Danach wurden 100 ml A. dest. hinzugegeben, eingemischt und wiederum verdampft. Dieser Vorgang wurde insgesamt dreimal durchgeführt. Die eingetrocknete Probe wurde dann in einige Milliliter Probenverdünnungspuffer aufgenommen, in einen 50 ml-Messkolben überführt und das Volumen anschließend mit Probenverdünnungspuffer bis zur Eichmarke aufgefüllt.
In Abhängigkeit vom Rp-Gehalt der Probe erfolgte vor Durchführung der Messung eine weitere Zugabe von Probenverdünnungspuffer. Es wurde außerdem ein interner Standard zugegeben. Zur Analyse der Met- und Cys-Gehalte wurde abschließend eine Ionenaustauschchromatographie in einem Aminosäurenanalysator (LC 3000 Amino Acid Analyzer, Fa. Eppendorf Biotronik, Maintal) durchgeführt.
Nicht-schwefelhaltige Aminosäuren
Für die Analyse aller weiteren Aminosäuren wurde ein Aufschluss durch saure Hydrolyse vorgenommen. Dazu wurden 0,5 g des Probenmaterials in ein Probenaufschlussgerät eingewogen und mit 80 ml 6-molarer HCl versetzt. Die Hydrolyse erfolgte durch Kochen der
Material und Methoden
- 57 -
Probe bei 110 °C über Nacht für mindestens acht Stunden in einem Aufschlussgerät (Kjeldatherm®, Fa. C. Gerhardt GmbH & Co. KG, Königswinter). Im Anschluss wurde die im Wasserbad abgekühlte Probe mit Salzsäure (c = 6 mol/l) durch einen Schwarzbandfilter (Rundfilter, aschefrei, Ø 90 mm; Fa. IDL GmbH & Co. KG, Nidderau) in einen 100 ml-Messkolben überführt.
Es wurde dann ein interner Standard zur Probe hinzugefügt, dessen eingesetzte Menge in Abhängigkeit vom Rp-Gehalt der zu untersuchenden Probe variierte. Das Probenvolumen wurde dann mit Salzsäure (c = 6 mol/l) auf 100 ml aufgefüllt und 1 ml davon in einen 50 ml-Spitzkolben pipettiert. Im Wasserbad (max. 60 °C) wurde die Probe am Rotationsverdampfer eingetrocknet und anschließend mit etwa 10 ml destillierten Wassers aufgefüllt. Das Wasser wurde verdampft und dieser Vorgang noch zweimal wiederholt. Die Probe wurde in Abhängigkeit vom Rp-Gehalt wiederum mit einem Probenverdünnungspuffer diluiert und der Analyse mittels Ionenaustauschchromatographie in einem Aminosäurenanalysator (LC 3000 Amino Acid Analyzer, Fa. Eppendorf Biotronik, Maintal) zugeführt.
3.4.3.6 Vitamine
In den verwendeten Mischfuttervarianten wurden die Gehalte an Vitamin D3 sowie an Vitamin E analysiert. Das jeweilige Vorgehen wird im Folgenden erläutert.
Vitamin D3
Die Vitamin D3-Gehalte in den eingesetzten MF wurden durch die LUFA Speyer nach amtlicher Methode (VDLUFA III 13.8.1) bestimmt.
Vitamin E (α-Tocopherol)
Die Vitamin E-Gehalte wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. 1 g des Probenmaterials wurde dazu in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen eingewogen und mit 1 ml Ascorbinsäure (15 %-ig), 2 ml Ethanol, 1 ml Methanol und 1 ml KOH-Lösung (c = 10 mol/l) versetzt.
Im Anschluss wurde das Röhrchen, um vorhandenen Sauerstoff zu verdrängen, mit Stickstoff gespült und verschlossen. Nach Durchmischung der Probe mit einem Reagenzglasschüttler folgte eine 30-minütige Inkubation im Wasserbad bei 60 °C, wobei der Probenansatz im fünf Minuten-Rhythmus erneut durchmischt wurde. Anschließend wurde die Probe zunächst unter fließendem Wasser auf Raumtemperatur herunter gekühlt und dann für 10 Minuten mit 10 ml Hexan (HPLC Grade 0,1 % BHT) in einem Überkopfschüttler gemischt. Der nach
- 58 -
Zentrifugation (zwei Minuten, 3000 U/min) gewonnene Überstand wurde in einen 50 ml-Spitzkolben pipettiert. Das Reagenzröhrchen wurde daraufhin noch weitere drei Mal mit je
Zentrifugation (zwei Minuten, 3000 U/min) gewonnene Überstand wurde in einen 50 ml-Spitzkolben pipettiert. Das Reagenzröhrchen wurde daraufhin noch weitere drei Mal mit je