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Abbildung 3.32:
Lichtmikroskopische Darstellung der Plazenta einerLPS-behandelten Maus.
Erkennbar sind vermehrte Ansammlungen von Entzündungszellen (schwar-ze Pfeile) und ein ödematös verdicktes Chorioamnion (roter Pfeil).
3.7 Surfactantprotein-Expression auf m
RNA- und Proteinebene
PCR
Die Ergebnisse der Surfactantprotein-mRNA-Expression sind in Abb. 3.33 dargestellt. Auf mRNA-Ebene verursachte dieLPS-Behandlung eine Hochregulation der mRNAder KollektineSP-A(0,6 ± 0,2 −DDCt,n= 13,
SP−A SP−B SP−C SP−D Relative mRNA−Expression (−DDCt), normalisiert zu Aktin −4
−3
PCR: Darstellung der Surfactantprotein-mRNA-Expression in LungenLPS -behandelter Mäusefeten. Die dargestelltenWerte sind als relative Abwei-chungen gegenüber den jeweiligen Kontrollgruppen aufgetragen (LPS+/−
imVerhältnis zur Kontrollgruppe NaCl +/−,LPS−/− im Verhältnis zur Kon-trollgruppe NaCl −/−). Signifikanzen im Stammvergleich sind mit Pluszei-chen, gegenüber Kontrollgruppen mit Sternchen gekennzeichnet. InLPS -behandelten Lungen vonErbB4heart−/−-Feten war eine signifikante Herab-regulation der SP-A- und SP-D-mRNAgegenüber Lungen LPS-behandelter Wildtyp-Feten nachweisbar.
p= 0,2) undSP-D (0,7 ± 0,3 −DDCt,n= 13,p= 0,3) sowie eine signifi-kante Herabregulation der mRNAvonSP-B(−2,7 ± 0,4 −DDCt,n= 10, p= 0,003) undSP-C(−3,1 ± 0,2 −DDCt,n= 15,p< 0,0001) in heterozygoten Kontrolltieren.
Aus der Kombination vonLPS-Exposition undErbB4-Deletion resul-tierte eine Herabregulation der mRNA-Expression aller vier Surfactant-proteine (SP-A: −1,0 ± 0,5 −DDCt,n= 11,p= 0,2;SP-B: −1,1 ± 0,6 −DDCt, n= 10, p= 0,1; SP-C: −1,3 ± 0,5 −DDCt, n= 11, p= 0,2; SP-D: −0,7 ± 0,6 −DDCt,n= 10,p= 0,5).
3.7 Surfactantprotein-Expression auf mRNA- und Proteinebene DieLPS-Behandlung führte zu einer signifikanten Erniedrigung der mRNA-Expression vonSP-A(−1,6 ± 0,5 −DDCt, n= 11,p= 0,004) und
SP-D(−1,4 ± 0,6 −DDCt,n= 10,p= 0,040) und einem signifikanten An-stieg der mRNA-Expression vonSP-B(1,4 ± 0,5 −DDCt,n= 10,p= 0,040)
SP-C(1,8 ± 0,5 −DDCt,n= 11,p= 0,0007) inErbB4-deletierten Lungen, verglichen mit Lungen derLPS-behandelten, heterozygoten Kontroll-tiere.
Western Blot
Die Ergebnisse desWestern Blots sind in Abb. 3.34 dargestellt. Die Behandlung mit LPS wirkte sich in Lungen von Wildtyp-Feten in Form einer signifikanten Stimulation der Proteinexpression vonSP-B
(234 % ± 31 %,n= 14,p= 0,008) undSP-C(210 % ± 23 %,n= 13,p= 0,002) aus. Die Expression vonSP-Awar in diesen Lungen unverändert (95 %
± 11 %,n= 11) und vonSP-Dsignifikant erniedrigt (65 % ± 5 %,n= 11, p= 0,001).
Dieser stimulatorische Effekt wurde durch die Kombination vonLPS -Applikation undErbB4-Deletion potenziert und führte zur signifikant erhöhten Expression von SP-A(203 % ± 24 %,n= 5,p= 0,009) sowie signifikant höheren Niveaus derSP-B- (373 % ± 50 %,n= 8,p= 0,004) und SP-C-Proteingehalte (329 % ± 37 %, n= 8, p= 0,002) gegenüber NaCl-behandelten Kontrollen. Die Proteinexpression vonSP-Dänderte sich hierbei nicht signifikant (84 % ± 5 %,n= 8).
Die Behandlung mitLPSsteigerte weiterhin signifikant die Protein-expression von SP-A (108 % ± 11 %, p= 0,0003), SP-B (139 % ± 31 %, p= 0,02),SP-C(119 % ± 23 %,p= 0,009) undSP-D(19 % ± 5 %,p= 0,02) inErbB4-deletierten Lungen im Vergleich zuLPS-behandelten, hetero-zygoten Kontrolltieren.
SP−A SP−B SP−C SP−D
Expression in % der NaCl−Kontrollgruppe
0
Western Blot:Darstellung der Surfactantprotein-Expression in LungenLPS -behandelter Mäusefeten. Die dargestelltenWerte sind als relative Abwei-chungen in Prozent gegenüber den jeweiligen Kontrollgruppen aufgetragen (LPS+/− imVerhältnis zur Kontrollgruppe NaCl +/−,LPS−/− im Verhältnis zur Kontrollgruppe NaCl −/−). Signifikanzen im Stammvergleich sind mit Pluszeichen, gegenüber Kontrollgruppen mit Sternchen gekennzeichnet.
ErbB4-Deletion verstärkte denLPS-induzierten Zuwachs der Proteinexpres-sion aller vier Surfactantproteine.
. Kapitel 4
Diskussion
4.1 Methoden
Intrauterine LPS-Exposition initiiert eine Verzögerung der fetalen Lungenentwicklung(Ueda et al. 2006). Strukturell vergleichbare Ver-zögerungen sind im LungenparenchymErbB4-deletierter Mäuse nach-weisbar (Purevdorj et al. 2008). In dieser Arbeit wurden die additiven Effekte von pränatalerLPS-Exposition undErbB4-Deletion untersucht und am Infektionsmodell einer pränatal induzierten Chorioamnioni-tis an transgenen,ErbB4-deletierten Mäusen (Gassmann et al. 1995) angewandt. Der strukturelle Vergleich mitLPS-exponierten Lungen desErbB4-Wildtyps sowie den anderen Versuchsgruppen lässt Rück-schlüsse über eine mögliche Beteiligung sowie die Funktion desErbB 4-Rezeptors innerhalb inflammatorischer Prozesse zu.
Der Injektionszeitpunkt anGD17 wurde gewählt, um die Entnahme der fetalen Lungen nach 24 Stunden Expositionsdauer durch dasLPS
anGD18 vornehmen zu können. Der 18. Gestationstag markiert den Übergang vom kanalikulären ins sakkuläre Stadium der murinen Lungenentwicklung. Dieses Stadium ist nur von kurzer zeitlicher Dauer, es beinhaltet aber essentielle Reifungsprozesse des Lungenpa-renchyms wie Kapillarisierung, Differenzierungsprozesse des Alveo-larepithels, weiterhin Interaktionen zwischen Mesenchym undAE II, welche zur Aufnahme der Surfactantsynthese führen. Mögliche Ver-zögerungen der Lungenreife können zu diesem Zeitpunkt besonders sensitiv beurteilt werden.
Die Injektionsart in Form einer transperitonealen, intraamnionalen Injektion wurde gewählt, um die Amnionhöhlen nicht chirurgisch zu öffnen. Somit wurden iatrogen induzierte Einflussfaktoren in Form
von Wundinfektionen und postoperativem Stress vermieden. Der Ver-teilungsnachweis der Injektionslösung wurde durch die Kombination derLPS-Lösung mit dem allergie- und stoffwechselneutralen Farbstoff Patentblau V erbracht. So konnte die gleichmäßige Verteilung der Injektionslösung durch alle Amnionhöhlen optisch dargestellt und überprüft werden. Die Injektionsdosis desLPSwurde dabei so gewählt, dass ein intrauteriner Tod durch septischen Schock weitestgehend ausgeschlossen werden konnte (siehe Abschnitt 2.1.2).
Die inflammatorische Wirkung derLPS-Injektion wurde via Zytospots anhand einer signifikanten, relative Granulozytose im Muttertierblut
LPS-behandelter Tiere gegenüber NaCl-behandelten Kontrolltieren nachgewiesen (siehe Abschnitt 3.1). Diese ist unter anderem auf die Rekrutierung proinflammatorischer Zellen wiePMNzur maternalen Uteruswand und in die Amnionhöhlen zurückzuführen.Versprengte Teile derLPS-Injektion in die maternale Peritonealhöhle unterstüt-zen diesen inflammatorischen Effekt. Diese Beobachtung steht im Einklang mit Studien, welche eine chemotaktische Aktivität und die forcierte Freisetzung von Granulozyten aus dem Knochenmark ins Blut in Richtung eines Entzündungsfokus aufzeigten (Kramer et al.
2001, Furze & Rankin 2008).
Um dieWirkung derLPS-Injektion auf den Fetus nachzuweisen, wur-den die Feten nach Entnahme aus dem Mutterleib gewogen und hinsichtlich morphologischer Auffälligkeiten beurteilt (siehe Ab-schnitt 3.2). Zur objektiven Beurteilung von Differenzen und Ver-zögerungen der Lungenentwicklung wurden verschiedene Parameter, welche als Maß für die morphologische Lungenausreifung angese-hen werden können, mit dem Punkt-Schnittpunkt-Zählverfahren nach Weibel (1979) morphometrisch bestimmt. Zur Beurteilung des morphologischen Reifezustands der fetalen Lunge diente hierbei ins-besondere die Bestimmung der Volumendichten des Mesenchyms sowie der Alveolarsepten. Als Parameter für die am Gasaustausch teilnehmenden Lufträume wurden die Volumendichte der Sacculi und Ductus sowie die Oberflächendichte bestimmt.
Da murine fetale Lungen unterschiedlich weit differenzierte Zonen aufweisen (Burri & Moschopulos 1992), wurde bei der Probengewin-nung darauf geachtet, dass alle Areale der linken Lunge die gleiche Chance erhielten, standardisiert ausgewertet zu werden (Howard
& Reed 2005). Hierzu wurde ein entsprechendes Schnittprotokoll entwickelt, welches vorsieht, die Lungen von apikal nach basal
aufzu-4.2 Lungenentwicklung,ErbB4-Rezeptoren undErbB4-Deletion