Das Körpergewicht derLPS-exponierten Feten (0,99 ± 0,02 g,n= 18) war im Vergleich zu NaCl-behandelten Feten (1,34± 0,06 g,n= 14, p= 0,0001) signifikant erniedrigt (siehe Abb. 3.2).
LPS-behandelte Feten sahen nach Entnahme aus den Amnionhöhlen imVergleich zu NaCl-behandelten Tieren unterentwickelt aus. Bei näherer Betrachtungfielen beiLPS-behandelten Feten insbesondere ein blasses Hautkolorit sowie eine geringere Körpergröße mit un-terentwickelten Extremitäten auf, was mit dem gemessenen, ernied-rigten Körpergewicht nachLPS-Behandlung korreliert. Die Lungen und Gehirne derLPS-exponierten Tiere sahen im Vergleich zur Kon-trollgruppe blass und weich aus, desweiterenfielen geschlossene und unterentwickelte Augenanlagen auf (siehe Abb. 3.3 und 3.4).
Abbildung 3.2:
Fetale Gewichte ± Standardfeh-ler. LPS-exponierte Feten waren gegenüber der NaCl-behandelten Kontrollgruppe signifikant unter-gewichtig.
NaCl LPS
Behandlung
Gewicht in g
0.0 0.5 1.0 1.5
(n = 14) (n = 18) p < 0,0001*
↗
Abbildung 3.5:
Lichtmikroskopische Darstellung des Lungenparenchyms eines 18 Tage alten, NaCl-behandeltenWildtyp-Fetus. Regelrechte morphologische und zeitgerechte Entwicklung von Sacculi (Pfeil).H. E.-Färbung.
3.3 Histologie
← ↗
Abbildung 3.6:
Lichtmikroskopische Darstellung des Lungenparenchyms eines 18 Tage alten, NaCl-behandeltenErbB4heart−/−-Fetus: Blockartig kompartimentiertes Mesenchym (roter Pfeil) zwischen sacculär-alveolären Bereichen (schwarzer Pfeil); verzögerte morphologische Lungenausreifung.H. E.-Färbung.
Wildtyp- undErbB4heart−/−-Mäusefeten nachLPS-Gabe
Das histologische Bild derLPS-behandelten Wildtyp-Feten wies Ähn-lichkeiten zu NaCl-behandelten Lungen vonErbB4heart−/−-Feten auf.
Der Anteil fetalen Mesenchyms war in beiden Gruppen erhöht (siehe Abb. 3.6 und 3.7).
Das LungenparenchymLPS-behandelterErbB4heart−/−-Feten wies die dramatischste Verzögerung der morphologischen Lungenausreifung auf. Das histologische Bild war größtenteils von Ansammlungen me-senchymalen Gewebes sowie von Entzündungszellen geprägt; nur vereinzelt waren vollständig entwickelte Sacculi, wie im Lungenpa-renchym von Kontrolltieren, nachweisbar (siehe Abb. 3.8 und 3.9).
→
↙
Abbildung 3.7:
Lichtmikroskopische Darstellung des Lungenparenchyms eines 18 Tage al-ten,LPS-behandeltenWildtyp-Fetus: Blockartig kompartimentiertes Mesen-chym (roter Pfeil) zwischen sacculären Arealen (schwarzer Pfeil); verzögerte morphologische Lungenausreifung.H. E.-Färbung.
3.3 Histologie
↙
↙
←
←
Abbildung 3.8:
Lichtmikroskopische Darstellung des Lungenparenchyms eines 18 Tage alten,LPS-behandeltenErbB4heart−/−-Fetus:Undifferenzierte Zellen und Me-senchymzellen (rote Pfeile) sowie Granulozyten (schwarze Pfeile), deutlich verminderte Ausbildung gasaustauschender Areale.H. E.-Färbung.
↙
↘
→
↓
25 µm
Abbildung 3.9:
Lichtmikroskopische Detailaufnahme eines mesenchymalen Areals des unterentwickelten Lungenparenchyms einesLPS-behandeltenErbB4heart−/− -Fetus. Mesenchymzellen (schwarze Pfeile) und Granulozyten (rote Pfeile) sind erkennbar.H. E.-Färbung.
3.3.2 Stereologische Befunde
Im Vergleich zu allen anderen Gruppen war die Volumenfraktion des fetalen Mesenchyms mit 4,97± 1,49 % (n= 7) in Lungen der NaCl-be-handeltenWildtyp-Feten signifikant am niedrigsten (siehe Abb. 3.10).
Diese Daten korrelieren mit den qualitativen Befunden (vgl. Abb. 3.5).
Das Lungenparenchym vonErbB4heart−/−-Feten wies im Vergleich zu Lungen NaCl-behandelter Wildtyp-Feten signifikant erhöhte Antei-le an Mesenchym auf (13,38± 1,80 %,n= 7,p= 0,004; vgl. Abb. 3.10), welche blockartig zwischen gasaustauschenden Arealen verstreut lagen (siehe Abb. 3.6). Ebenfalls führte dieLPS-Behandlung im Lun-genparenchym von Wildtyp-Feten zu einem signifikanten Anstieg der Volumendichte des fetalen Mesenchyms (20,08± 4,26 %,n= 10, p= 0,012) imVergleich zu den NaCl-behandelten Kontrolltieren (siehe Abb. 3.7 und 3.10). Nach LPS-Applikation fand sich in Lungen von
ErbB4heart−/−-Feten verglichen mit allen anderen Gruppen der
signi-3.3 Histologie
Volumendichten des Mesenchyms: Mittelwerte ±SEM. Eine hohe mesen-chymale Volumendichte repräsentiert eine noch unvollständige morpho-logische Lungenausreifung anGD18. Sowohl eineErbB4-Deletion in NaCl-behandelten Tieren als auch dieLPS-Exposition in Lungen von Wildtyp-Feten verursachte erhöhte mesenchymaleVolumendichten. Die signifikant höchsten mesenchymalen Volumendichten fanden sich im Lungenparen-chymLPS-behandelter,ErbB4-deletierter Feten.
fikant höchste Anteil an fetalem Mesenchym (47,82± 5,38 %, n= 8, p= 0,0008|<0,0001|<0,0001; vgl. Abb. 3.10).
DieVeränderungen der mesenchymalen Volumendichten korrelie-ren eng mit den Daten der Volumendichte der gesamten Lufträume (Vv Lufträume total,siehe Abb. 3.11). Beide Parameter verhalten sich ent-gegengesetzt zueinander. Ein erhöhter Anteil an Mesenchym führt zu einem erniedrigtem Volumenanteil der Lufträume. In Lungen NaCl-behandelter Wildtyp-Feten wurde ein vergleichsweise hoher Volumenanteil der Lufträume ermittelt (45.08± 2,07 %, n= 7), wel-cher zu diesem Zeitpunkt einer regelrechten Lungenentwicklung entspricht. ErbB4-deletierte Lungen zeigten dem gegenüber einen etwas geringerenVolumenanteil der Lufträume (40,56± 1,79 %,n= 7).
Vv Lufträume total in %
Volumendichten der Lufträume: Mittelwerte ±SEM. Hohe Volumendich-ten der Lufträume repräsentieren eine vorangeschritVolumendich-tene morphologische Ausreifung der fetalen Lunge anGD 18. SowohlErbB4-Deletion als auch
LPS-Behandlung führten für sich genommen zu einer Inhibierung der Lun-genentwicklung. Die Kombination aus beiden Faktoren ergab die signifikant niedrigsten Volumendichten der fetalen Lufträume.
Nach LPS-Behandlung wiesen die Lungen von Wildtyp-Feten ver-glichen mit der NaCl-behandelten Kontrollgruppe einen signifikan-ten Verlust der Lufträume auf (31,00± 2,32 %,n= 10,p= 0,0006). In
ErbB4-deletierten,LPS-behandelten Lungen fanden sich signifikant erniedrigteVolumenfraktionen der Lufträume (22,60± 2,42 %,n= 8, p= 0,002|<0,0001|<0,0001) imVergleich zu allen anderen Gruppen.
Die Oberflächendichte als quantitatives Maß für die Gasaustausch-oberfläche war in den Lungen LPS-behandelter Wildtyp-Feten mit 0,037± 0,002 µm2/µm3 (n= 10) gegenüber Lungen von NaCl-behan-delten Kontrolltieren (0,050 ± 0,003 µm2/µm3, n= 7,p= 0,003) signi-fikant erniedrigt (siehe Abb. 3.12). Es ergaben sich keine quantita-tiven Unterschiede hinsichtlich der Oberflächendichte in Lungen von NaCl-behandeltenWildtyp-Feten gegenüber NaCl-behandelten
3.3 Histologie
Oberflächendichte Sv in µm2 /µm3
0.00
OberflächendichteSv: Mittelwerte ±SEM. Die Oberflächendichte als quanti-tatives Maß für die pulmonale Gasaustauschfläche war inLPS-behandelten Wildtyplungen erniedrigt und inLPS-behandelten,ErbB4-deletierten Lungen signifikant reduziert.
ErbB4heart−/−-Feten.LPS-behandelte Lungen vonErbB4heart−/−-Feten wie-sen mit 0,028± 0,003 µm2/µm3(n= 8,p= 0,020|0,002) sowohl gegen-überLPS-behandelten Lungen vonWildtyp-Feten als auch gegenüber NaCl-behandelten Lungen von ErbB4heart−/−-Feten eine signifikant erniedrigte Oberflächendichte auf.
Die Volumendichte der Alveolarsepten als ein Kriterium hinsichtlich des morphologischen Reifezustands der Lunge war mit 49,52± 1,73 % (n= 7) am höchsten in Lungen NaCl-behandelter Kontrolltiere. Im Vergleich zuLPS-behandelten Wildtyp-Feten (47,82± 4,49 %,n= 10) so-wie NaCl-behandeltenErbB4heart−/−-Feten (45,98 ± 1,88 %,n= 7) war die Volumendichte der Alveolarsepten in Lungen vonLPS-behandelten
ErbB4heart−/−-Feten mit 29,58± 3,54 %,n= 8,p= 0,007|0,002) signifikant erniedrigt (siehe Abb. 3.13).
Die Dicke der Alveolarsepten derLPS-behandelten Wildtyp-Feten war mit 12,91 µm± 1,61 µm (n= 10) am ausgeprägtesten gegenüber allen anderen Gruppen (vgl. Abb. 3.14). Jedoch waren diese Unterschiede gegenüber keiner der anderen Gruppen statistisch signifikant.
Vv Septen in %
0 10 20 30 40 50 60
NaCl +/−
(n = 7)
NaCl −/−
(n = 7)
LPS +/−
(n = 10)
LPS −/−
(n = 8)
* p = 0,002
* p = 0,007
Abbildung 3.13:
Volumendichte der Alveolarsepten: Mittelwerte ±SEM. Die Volumendichte der Alveolarsepten als Maß für den morphologischen Reifezustand der Lun-ge war inLPS-behandelten,ErbB4-deletierten Lungen signifikant erniedrigt.
3.3 Histologie
Septendicke in µm
0 2 4 6 8 10 12 14
NaCl +/−
(n = 7)
NaCl −/−
(n = 7)
LPS +/−
(n = 10)
LPS −/−
(n = 8)
Abbildung 3.14:
Septendicke: Mittelwerte ±SEM. Die Septendicke war inLPS-behandelten Wildtyp-Lungen am höchsten. Es ergaben sich jedoch keine statistischen Signifikanzen zu den anderenVersuchsgruppen.
3.3.3 Verteilung und Form der elastischen Fasern
In den Gefäßwänden sowie in den Alveolarsepten und den Eingängen der Alveolen von NaCl-behandelten Wildtyp-Feten waren vorwie-gend lange, dicke und strukturiert angeordnete Elastinfasern vorhan-den, welche auf eine normale Entwicklung der Blutgefäße und des Lungenparenchyms schließen lassen (siehe Abb. 3.15 und 3.16).
In Blutgefäßen sowie im Lungenparenchym NaCl-behandelter, ErbB4-deletierter Tiere fanden sich dünnere elastische Fasern, welche häufig ungeordnet und fragmentiert angeordnet waren (siehe Abb. 3.17 und 3.18).
↙ ↙
20 µm
Abbildung 3.15:
Lichtmikroskopische Darstellung von regelrecht angeordneten, symme-trisch ausgerichteten Elastinfasern in pulmonalen Blutgefäßwänden eines NaCl-behandeltenWildtyp-Fetus (Pfeile). Orcein-Färbung.
3.3 Histologie
→ ←
10 µm
Abbildung 3.16:
Lichtmikroskopische Detailaufnahme eines Alveolarseptums eines NaCl-behandeltenWildtyp-Fetus. Dargestellt sind zwei regelrecht ausgebildete, symmetrisch angeordnete Elastinfasern (Pfeile), welche im histologischen Bild dieser Lungen dominierten. Orcein-Färbung.
↓
↙
↑ ↖
25 µm
Abbildung 3.17:
Lichtmikroskopische Darstellung eines angeschnittenen, pulmonalen Blut-gefäßes im Lungenparenchym eines NaCl-behandeltenErbB4heart−/−-Fetus.
Erkennbar ist die ungeordnete und teils fragmentierte Anordnung der Elastinfasern in der Blutgefäßwand (rote Pfeile) und im Interstitium (schwarze Pfeile). Orcein-Färbung.
3.3 Histologie
↑
←
10 µm
Abbildung 3.18:
Lichtmikroskopische Detailaufnahme eines Alveolarseptums eines NaCl-behandeltenErbB4heart−/−-Fetus. Erkennbar sind ungeordnete und teils frag-mentierte Elastinfasern (Pfeile), welche das histologische Gesamtbild dieser Gruppe prägten. Orcein-Färbung.
Im Lungenparenchym und in BlutgefäßwändenLPS-behandelter Wild-typ-Feten fanden sich weniger elastische Fasern im Vergleich zu den NaCl-behandelten Kontrolltieren. Die Elastinfasern erschienen ausgedünnt und ungeordnet (siehe Abb. 3.19).
In den Wänden der Blutgefäße sowie im LungenparenchymErbB 4-deletierter,LPS-behandelter Feten fanden sich insgesamt diffus ver-teilte und weniger dicht angeordnete Elastinfasern. Die Struktur der einzelnen Fasern erschien dabei fragmentiert und ausgedünnt (siehe Abb. 3.20 und 3.21).
↑
↓ ↘
↙
25 µm
Abbildung 3.19:
Lichtmikroskopische Darstellung eines angeschnittenen pulmonalen Blutge-fäßes sowie des Lungenparenchyms einesLPS-behandeltenWildtyp-Fetus.
In der Blutgefäßwand fand sich eine reduzierte Anzahl ausgedünnter und ungeordneter Elastinfasern (rote Pfeile), welche in dieser Form ebenfalls im Lungenparenchym nachweisbar waren (schwarze Pfeile). Orcein-Färbung.
3.3 Histologie
↘ ↘
↗
25 µm
Abbildung 3.20:
Lichtmikroskopische Darstellung der Blutgefäßwand einesLPS-behandelten
ErbB4heart−/−-Fetus. Es fanden sich massiv fragmentierte, ausgedünnte und diffus angeordnete Elastinfasern (rote Pfeile). Diese pathologischen Auffälligkeiten waren im Vergleich zu allen anderen Gruppen am stärksten ausgeprägt. Orcein-Färbung.
↗
↗
↖
25 µm
Abbildung 3.21:
Lichtmikroskopische Detailaufnahme des Lungenparenchyms eines LPS -behandeltenErbB4heart−/−-Fetus. Die dargestellten Elastinfasern ließen keine regelmäßige Anordnung erkennen und erschienen stark fragmentiert und ausgedünnt (Pfeile). Orcein-Färbung.
3.4 Immunhistochemie – Entzündungsstatus der Lunge
3.4 Immunhistochemie – Entzündungsstatus der Lunge
3.4.1 Qualitative Befunde
Durch die Immunfärbung gegen das auf der Oberfläche von Entzün-dungszellen befindliche β2-IntegrinCD11b konnte in den jeweiligen Versuchsgruppen ein potenzieller Einstrom von Makrophagen (siehe Abb. 3.22) und neutrophilen Granulozyten (siehe Abb. 3.23) nach-gewiesen und somit der Entzündungsstatus der jeweiligen Lunge definiert werden.
Das Lungenparenchym von NaCl-behandelten Wildtyp-Feten zeigte keine Entzündungszeichen (siehe Abb. 3.24). Es konnten vereinzelt
CD11b-positive Zellen (Alveolarmakrophagen und neutrophile Gra-nulozyten) nachgewiesen werden.
←
→
10 µm
Abbildung 3.22:
Lichtmikroskopische Detailaufnahme der quantifizierten Entzündungszel-len:CD11b-positive Makrophagen in einer Alveolarlichtung (Pfeile). Immun-färbung gegenCD11b.
↗
25 µm
Abbildung 3.23:
Immunhistochemische, lichtmikroskopische Detailaufnahme der quantifi -zierten Entzündungszellen: CD11b-positiver neutrophiler Granulozyt im Alveolarseptum (Pfeil). Immunfärbung gegenCD11b.
3.4 Immunhistochemie – Entzündungsstatus der Lunge
Abbildung 3.24:
Immunhistochemische, lichtmikroskopische Darstellung des Lungenparen-chyms eines NaCl-behandeltenWildtyp-Fetus. Blander Entzündungsstatus bei regelrechter morphologischer Ausbildung von Alveolarräumen. Kein Nachweis vonCD11b-positiven Entzündungszellen. Immunhistochemie ge-genCD11b.
Das Lungenparenchym NaCl-behandelter ErbB4heart−/−-Feten wies, verglichen mit Lungen von Wildtyp-Mäusen, Zeichen einer milden, pulmonalen Entzündungsreaktion auf. Dies konnte anhand der einge-wanderten,CD11b-positiven Entzündungszellen nachgewiesen und dargestellt werden (siehe Abb. 3.25).
Auch im Lungenparenchym LPS-behandelter Wildtyp-Feten waren
CD11b-positive Entzündungszellen auffindbar. Das Bild war vom his-tologischen Aspekt her mit dem Bild des Lungenparenchyms NaCl-behandelterErbB4heart−/−-Feten vergleichbar (siehe Abb. 3.26).
In Lungen fetalerErbB4heart−/−-Mäuse führte dieLPS-Behandlung zu einem massiven InfluxCD11b-positiver neutrophiler Granulozyten und Makrophagen in das Lungenparenchym (siehe Abb. 3.27). Dabei konnten CD11b-positive Entzündungszellen auch in den Alveolar-septen sowie im Interstitium des Lungenparenchyms nachgewiesen werden (siehe Abb. 3.28).
↘
→
↙
Abbildung 3.25:
Immunhistochemische, lichtmikroskopische Darstellung des Lungenparen-chyms eines NaCl-behandeltenErbB4heart−/−-Fetus: Zeichen einer milden, pulmonalen Entzündungsreaktion mit MigrationCD11b-positiver Zellen in das Lungenparenchym (Pfeile). Immunhistochemie gegenCD11b.
3.4 Immunhistochemie – Entzündungsstatus der Lunge
↖
↗
→
Abbildung 3.26:
Immunhistochemische, lichtmikroskopische Darstellung des Lungenparen-chyms einesLPS-behandeltenWildtyp-Fetus: Zeichen einer mäßigen, pul-monalen Entzündungsreaktion mit MigrationCD11b-positiver Zellen in das Lungenparenchym (Pfeile), vergleichbar mit dem Lungenparenchym NaCl-behandelterErbB4heart−/−-Feten (s. o.). Immunhistochemie gegenCD11b.
↗
↙ →
Abbildung 3.27:
Immunhistochemische, lichtmikroskopische Darstellung des Lungenparen-chyms einesLPS-behandeltenErbB4heart−/−-Fetus: Diapedese und massive MigrationCD11b-positiver Entzündungszellen in das Lungenparenchym (Pfeile). Es zeigte sich hier eine deutlich ausgeprägtere Entzündungsreak-tion im Vergleich zu allen anderen Gruppen. Immunhistochemie gegen
CD11b.
3.4 Immunhistochemie – Entzündungsstatus der Lunge
↖ ↗
25 µm
Abbildung 3.28:
Immunhistochemische, lichtmikroskopische Detailaufnahme des Lungen-parenchyms eines LPS-behandelten ErbB4heart−/−-Fetus. Zur Darstellung kommen zahlreicheCD11b-positive neutrophile Granulozyten im Alveolar-septum (Pfeile). Immunhistochemie gegenCD11b.
3.4.2 Morphometrische Befunde
In NaCl-behandelten Lungen von Wildtyp-Feten fand sich lediglich eine geringe Zelldichte an CD11b-positiven Makrophagen (9,06 ± 1,36 mm−2,n= 8). Im Vergleich zu dieser Kontrollgruppe waren die Zelldichten von Makrophagen im Lungenparenchym von NaCl-be-handeltenErbB4heart−/−-Feten (20,71 ± 1,46 mm−2,n= 8,p< 0,0001) so-wie von LPS-behandelten Wildtyp-Feten (12,45 ± 1,37 mm−2, n= 5, p= 0,003) signifikant erhöht. Im Vergleich zu Letzteren und den NaCl-behandelten ErbB4heart−/−-Feten war war die Zelldichte der
CD11b-positiven Makrophagen im LungenparenchymLPS -behandel-ter ErbB4heart−/−-Feten signifikant erhöht (53,67 ± 16,06 mm−2, n= 5, p= 0,030|0,020) (siehe Abb. 3.29).
Zelldichte QMakrophagen in mm−−2
0
Zelldichte derCD11b-positiven Makrophagen im Lungenparenchym. Signifi -kant höhere ZelldichtenCD11b-positiver Makrophagen fanden sich im Lun-genparenchym NaCl-behandelterErbB4heart−/−-Feten undLPS-behandelter Wildtyp-Feten imVergleich zum NaCl-behandeltenWildtyp. Die höchste Zelldichte an Makrophagen ließ sich im LungenparenchymLPS-behandelter
ErbB4heart−/−-Feten detektieren; dies repräsentiert dessen hohen entzündli-chen Status.
3.4 Immunhistochemie – Entzündungsstatus der Lunge Die Zelldichte vonCD11b-positiven neutrophilen Granulozyten war in NaCl-behandelten Lungen von Wildtyp-Feten im Vergleich zu allen anderen Gruppen am geringsten (26,25 ± 1,90 mm−2,n= 8). Im Vergleich zu dieser Kontrollgruppe waren die Zelldichten der neu-trophilen Granulozyten im Lungenparenchym vonErbB4heart−/−-Feten (89,47 ± 5,80 mm−2,n= 8,p< 0,0001) sowie vonLPS-behandelten Wild-typ-Feten (100,59 ± 3,45 mm−2,n= 5,p< 0,0001) signifikant erhöht. Die Zelldichte derCD11b-positiven neutrophilen Granulozyten im Lun-genparenchymLPS-behandelterErbB4heart−/−-Feten war im Vergleich zu allen anderen Gruppen signifikant erhöht (278,61 ± 39,69 mm−2,n= 5,p= 0,002|<0,0001|<0,0001) (siehe Abb. 3.30).
Zelldichte Qneutrophile Granulozyten in mm−−2
0
Zelldichte der CD11b-positiven neutrophilen Granulozyten im Lungen-parenchym. Signifikant höhere Zelldichten CD11b-positiver neutrophi-ler Granulozyten fanden sich im Lungenparenchym NaCl-behandelter
ErbB4heart−/−-Feten undLPS-behandelterWildtyp-Feten imVergleich zum NaCl-behandelten Wildtyp. Signifikant höhere Zelldichten von neutro-philen Granulozyten ließen sich gegenüber allen anderen Gruppen im LungenparenchymLPS-behandelterErbB4heart−/−-Feten detektieren und re-präsentieren dessen hohen entzündlichen Status.
3.5
TNF-α-Konzentrationen im Lungenparenchym
DieUnterschiede derTNF-α-Expression im Lungenparenchym von
LPS-behandeltenWildtyp-Feten gegenüber NaCl-behandelten Wild-typ-Feten waren nicht signifikant (siehe Abb. 3.31). Hingegen führte dieLPS-Applikation zu einer signifikant höherenTNF-α-Expression in
ErbB4-deletierten Lungen von 132 ± 10 % (n= 8,p= 0,046) im Vergleich zu NaCl-behandelten Wildtyp- oderErbB4-deletierten Kontrolllungen (100 ± 13 %,n= 4; 100 ± 14 %,n= 4) (siehe Abb. 3.31). Somit verstärkte
LPSden Zuwachs derTNF-α-Expression inErbB4-deletierten fetalen Lungen.
Expression in % der NaCl−Kontrollgruppe
0 50 100 150
NaCl +/−
(n = 4)
LPS +/−
(n = 10)
NaCl −/−
(n = 4)
LPS −/−
(n = 8) p = 0,046*
Abbildung 3.31:
TNF-α-Konzentrationen im Lungenparenchym. NaCl +/− und NaCl −/−
entsprechen den Referenzwerten (100 %). Die Unterschiede in den LPS -behandelten Gruppen wurden in Relation zu den Kontrollreferenzwerten angegeben. InLPS-behandelten Lungen vonErbB4-deletierten Feten wurden signifikant höhereTNF-α-Konzentrationen gegenüber NaCl-behandelten,
ErbB4-deletierten Feten gemessen. ImVergleich dazu zeigte sich kein sta-tistisch zu sichernderUnterschied zwischenLPS- und NaCl-behandelten Lungen des Wildtyps.
3.6 Entzündungsstatus der Plazenta
3.6 Entzündungsstatus der Plazenta
Die fetale und maternale Seite der Plazenten LPS-behandelter Tie-re wies lokal vermehrte Ansammlungen von Entzündungszellen auf. Zusätzlich erschien das Chorioamnion ödematös verdickt (siehe Abb. 3.32).
←
↙
↘ →
Abbildung 3.32:
Lichtmikroskopische Darstellung der Plazenta einerLPS-behandelten Maus.
Erkennbar sind vermehrte Ansammlungen von Entzündungszellen (schwar-ze Pfeile) und ein ödematös verdicktes Chorioamnion (roter Pfeil).
3.7 Surfactantprotein-Expression auf m
RNA- und Proteinebene
PCR
Die Ergebnisse der Surfactantprotein-mRNA-Expression sind in Abb. 3.33 dargestellt. Auf mRNA-Ebene verursachte dieLPS-Behandlung eine Hochregulation der mRNAder KollektineSP-A(0,6 ± 0,2 −DDCt,n= 13,
SP−A SP−B SP−C SP−D Relative mRNA−Expression (−DDCt), normalisiert zu Aktin −4
−3
PCR: Darstellung der Surfactantprotein-mRNA-Expression in LungenLPS -behandelter Mäusefeten. Die dargestelltenWerte sind als relative Abwei-chungen gegenüber den jeweiligen Kontrollgruppen aufgetragen (LPS+/−
imVerhältnis zur Kontrollgruppe NaCl +/−,LPS−/− im Verhältnis zur Kon-trollgruppe NaCl −/−). Signifikanzen im Stammvergleich sind mit Pluszei-chen, gegenüber Kontrollgruppen mit Sternchen gekennzeichnet. InLPS -behandelten Lungen vonErbB4heart−/−-Feten war eine signifikante Herab-regulation der SP-A- und SP-D-mRNAgegenüber Lungen LPS-behandelter Wildtyp-Feten nachweisbar.
p= 0,2) undSP-D (0,7 ± 0,3 −DDCt,n= 13,p= 0,3) sowie eine signifi-kante Herabregulation der mRNAvonSP-B(−2,7 ± 0,4 −DDCt,n= 10, p= 0,003) undSP-C(−3,1 ± 0,2 −DDCt,n= 15,p< 0,0001) in heterozygoten Kontrolltieren.
Aus der Kombination vonLPS-Exposition undErbB4-Deletion resul-tierte eine Herabregulation der mRNA-Expression aller vier Surfactant-proteine (SP-A: −1,0 ± 0,5 −DDCt,n= 11,p= 0,2;SP-B: −1,1 ± 0,6 −DDCt, n= 10, p= 0,1; SP-C: −1,3 ± 0,5 −DDCt, n= 11, p= 0,2; SP-D: −0,7 ± 0,6 −DDCt,n= 10,p= 0,5).
3.7 Surfactantprotein-Expression auf mRNA- und Proteinebene DieLPS-Behandlung führte zu einer signifikanten Erniedrigung der mRNA-Expression vonSP-A(−1,6 ± 0,5 −DDCt, n= 11,p= 0,004) und
SP-D(−1,4 ± 0,6 −DDCt,n= 10,p= 0,040) und einem signifikanten An-stieg der mRNA-Expression vonSP-B(1,4 ± 0,5 −DDCt,n= 10,p= 0,040)
SP-C(1,8 ± 0,5 −DDCt,n= 11,p= 0,0007) inErbB4-deletierten Lungen, verglichen mit Lungen derLPS-behandelten, heterozygoten Kontroll-tiere.
Western Blot
Die Ergebnisse desWestern Blots sind in Abb. 3.34 dargestellt. Die Behandlung mit LPS wirkte sich in Lungen von Wildtyp-Feten in Form einer signifikanten Stimulation der Proteinexpression vonSP-B
(234 % ± 31 %,n= 14,p= 0,008) undSP-C(210 % ± 23 %,n= 13,p= 0,002) aus. Die Expression vonSP-Awar in diesen Lungen unverändert (95 %
± 11 %,n= 11) und vonSP-Dsignifikant erniedrigt (65 % ± 5 %,n= 11, p= 0,001).
Dieser stimulatorische Effekt wurde durch die Kombination vonLPS -Applikation undErbB4-Deletion potenziert und führte zur signifikant erhöhten Expression von SP-A(203 % ± 24 %,n= 5,p= 0,009) sowie signifikant höheren Niveaus derSP-B- (373 % ± 50 %,n= 8,p= 0,004) und SP-C-Proteingehalte (329 % ± 37 %, n= 8, p= 0,002) gegenüber NaCl-behandelten Kontrollen. Die Proteinexpression vonSP-Dänderte sich hierbei nicht signifikant (84 % ± 5 %,n= 8).
Die Behandlung mitLPSsteigerte weiterhin signifikant die Protein-expression von SP-A (108 % ± 11 %, p= 0,0003), SP-B (139 % ± 31 %, p= 0,02),SP-C(119 % ± 23 %,p= 0,009) undSP-D(19 % ± 5 %,p= 0,02) inErbB4-deletierten Lungen im Vergleich zuLPS-behandelten, hetero-zygoten Kontrolltieren.
SP−A SP−B SP−C SP−D
Expression in % der NaCl−Kontrollgruppe
0
Western Blot:Darstellung der Surfactantprotein-Expression in LungenLPS -behandelter Mäusefeten. Die dargestelltenWerte sind als relative Abwei-chungen in Prozent gegenüber den jeweiligen Kontrollgruppen aufgetragen (LPS+/− imVerhältnis zur Kontrollgruppe NaCl +/−,LPS−/− im Verhältnis zur Kontrollgruppe NaCl −/−). Signifikanzen im Stammvergleich sind mit Pluszeichen, gegenüber Kontrollgruppen mit Sternchen gekennzeichnet.
ErbB4-Deletion verstärkte denLPS-induzierten Zuwachs der Proteinexpres-sion aller vier Surfactantproteine.
. Kapitel 4
Diskussion
4.1 Methoden
Intrauterine LPS-Exposition initiiert eine Verzögerung der fetalen Lungenentwicklung(Ueda et al. 2006). Strukturell vergleichbare Ver-zögerungen sind im LungenparenchymErbB4-deletierter Mäuse nach-weisbar (Purevdorj et al. 2008). In dieser Arbeit wurden die additiven Effekte von pränatalerLPS-Exposition undErbB4-Deletion untersucht und am Infektionsmodell einer pränatal induzierten Chorioamnioni-tis an transgenen,ErbB4-deletierten Mäusen (Gassmann et al. 1995) angewandt. Der strukturelle Vergleich mitLPS-exponierten Lungen desErbB4-Wildtyps sowie den anderen Versuchsgruppen lässt Rück-schlüsse über eine mögliche Beteiligung sowie die Funktion desErbB 4-Rezeptors innerhalb inflammatorischer Prozesse zu.
Der Injektionszeitpunkt anGD17 wurde gewählt, um die Entnahme der fetalen Lungen nach 24 Stunden Expositionsdauer durch dasLPS
anGD18 vornehmen zu können. Der 18. Gestationstag markiert den Übergang vom kanalikulären ins sakkuläre Stadium der murinen Lungenentwicklung. Dieses Stadium ist nur von kurzer zeitlicher Dauer, es beinhaltet aber essentielle Reifungsprozesse des Lungenpa-renchyms wie Kapillarisierung, Differenzierungsprozesse des Alveo-larepithels, weiterhin Interaktionen zwischen Mesenchym undAE II, welche zur Aufnahme der Surfactantsynthese führen. Mögliche Ver-zögerungen der Lungenreife können zu diesem Zeitpunkt besonders sensitiv beurteilt werden.
Die Injektionsart in Form einer transperitonealen, intraamnionalen Injektion wurde gewählt, um die Amnionhöhlen nicht chirurgisch zu öffnen. Somit wurden iatrogen induzierte Einflussfaktoren in Form
von Wundinfektionen und postoperativem Stress vermieden. Der Ver-teilungsnachweis der Injektionslösung wurde durch die Kombination derLPS-Lösung mit dem allergie- und stoffwechselneutralen Farbstoff Patentblau V erbracht. So konnte die gleichmäßige Verteilung der Injektionslösung durch alle Amnionhöhlen optisch dargestellt und überprüft werden. Die Injektionsdosis desLPSwurde dabei so gewählt, dass ein intrauteriner Tod durch septischen Schock weitestgehend ausgeschlossen werden konnte (siehe Abschnitt 2.1.2).
Die inflammatorische Wirkung derLPS-Injektion wurde via Zytospots anhand einer signifikanten, relative Granulozytose im Muttertierblut
LPS-behandelter Tiere gegenüber NaCl-behandelten Kontrolltieren nachgewiesen (siehe Abschnitt 3.1). Diese ist unter anderem auf die Rekrutierung proinflammatorischer Zellen wiePMNzur maternalen Uteruswand und in die Amnionhöhlen zurückzuführen.Versprengte Teile derLPS-Injektion in die maternale Peritonealhöhle unterstüt-zen diesen inflammatorischen Effekt. Diese Beobachtung steht im Einklang mit Studien, welche eine chemotaktische Aktivität und die forcierte Freisetzung von Granulozyten aus dem Knochenmark ins Blut in Richtung eines Entzündungsfokus aufzeigten (Kramer et al.
LPS-behandelter Tiere gegenüber NaCl-behandelten Kontrolltieren nachgewiesen (siehe Abschnitt 3.1). Diese ist unter anderem auf die Rekrutierung proinflammatorischer Zellen wiePMNzur maternalen Uteruswand und in die Amnionhöhlen zurückzuführen.Versprengte Teile derLPS-Injektion in die maternale Peritonealhöhle unterstüt-zen diesen inflammatorischen Effekt. Diese Beobachtung steht im Einklang mit Studien, welche eine chemotaktische Aktivität und die forcierte Freisetzung von Granulozyten aus dem Knochenmark ins Blut in Richtung eines Entzündungsfokus aufzeigten (Kramer et al.