4 Diskussion
4.3 Struktur von intrapathogenen- und Pathogen-Wirt Inter- Inter-aktionsnetzwerken
Durch die bioinformatische Auswertung und die graphische Darstellung der Y2H Datensätze in Form von Interaktionsnetzwerken ist es möglich, charakteristische Eigenschaften und struktu-relle Unterschiede zu erkennen. Hierzu dienen verschiedene Parameter wie Netzwerktopolo-gie, Gradverteilung, Clustering Koeffizient, Anfälligkeit von Netzwerken und Grad und bet-weenness Zentralität. Zum Beispiel besitzen zelluläre und virale Protein-Protein Interaktions-netzwerke unterschiedliche Netzwerkparameter und Topologien. Die zellulären Netzwerke setzen sich aus einzelnen stark vernetzten Submodulen zusammen, die viralen Netzwerke hingegen zeigen keine solche Untergliederung 135, 159. Mittels Anwendung weiterer bioinforma-tischer Methoden wurden in unserer Studie aus den im Y2H-Screen gewonnenen Daten die Protein-Protein Interaktionsnetzwerke erstellt, kombiniert, und die o.g. Netzwerkparameter be-stimmt. Bei der Herstellung und Charakterisierung des Pathogen-Wirt Interaktionsnetzwerks von Y. enterocolitica konnte beobachtet werden, dass die sezernierten Proteine überzufällig häufig Interaktionen mit zellulären Proteinen zeigen, und dass die Proteine des TTSS
vor-ralität wurde gezeigt, dass Y. enterocolitica eng vernetzte und zentrale Proteine im zellulären PPI-Netzwerk angreift. Dieses Phänomen wurde auch bei Epstein-Barr Virus beobachtet160. Weiterhin wurde mittels funktioneller Auswertung gezeigt, dass die sezernierten Yersinia Pro-teine bevorzugt mit WirtsproPro-teinen interagieren, die an der Regulation der Transkription, Signaltransduktion, der Organisation des Aktinzytoskeletts und posttranslationellen Modifikati-onen funktionell beteiligt sind. Zusätzlich wurde aus unseren PPI-Daten ersichtlich, dass in der Regel jeweils mehrere Yersinia Proteine denselben Signalweg angreifen. Im intrapathogenen-PPI-Netzwerk wurde die charakteristische Pfadlänge nach zufälliger Eliminierung von einzel-nen Proteieinzel-nen bestimmt und mit zwei humaeinzel-nen Netzwerken verglichen 133, 134. Diese Simulati-on zeigte, dass das Y. enterocolitica Interaktom, wie auch virale Interaktome eine gegenüber humanen Netzwerken erhöhte Robustheit und Angriffstoleranz besitzt und weniger anfällig auf die Eliminierung bestimmter Proteine reagiert161. Die Netzwerkparameter können auch zur Aufdeckung von evolutionär konservierten Mechanismen benutzt werden. Mit Hilfe der Netz-werkdaten von fünf verschiedenen Herpesviren wurde ein Stammbaum erstellt, der die Ver-wandtschaftsverhältnisse zwischen den einzelnen Herpesvirus Spezies bestätigte 129, 159. Die Netzwerkstudien können weitere Anwendung in der Medizin finden. Anhand der Netzwerke können wichtige Angriffsstellen für antibakterielle Therapien identifiziert werden. Die identifi-zierten Interaktionsknotenpunkte, sogenannte Hubs, sind häufig Expressionsprodukte essen-tieller Gene. Man könnte die wichtigen Interaktionen mit Hilfe von Antikörpern, Peptiden oder anderen Molekülen unterbinden, oder die Proteinexpression durch siRNA herunterregulieren
162. Als Beispiel zeigt die Abbildung 28 ein zelluläres PPI-Netzwerk von S. cerevisiae. Die In-teraktionsknotenpunkte im Netzwerk von S. cerevisiae wurden gezielt deletiert und anschlie-ßend die entstandenen Phänotypen beobachtet. Die Eliminierung von Hubs war letal bei S.
cerevisiae, während die Deletion von schwach vernetzten Knoten zum verlangsamten Wachs-tum führte 120, 134.
Abbildung 28: Proteininteraktionen bei S. cerevisiae. Proteine werden durch Kreise (Kno-ten), Interaktionen durch Verbindungslinien (Kanten) symbolisiert. Die Farbe der Knoten gibt den beobachteten Phänotyp nach Deletion des jeweiligen Proteins an. Die Eliminierung roter Knoten ist letal für die Hefe, der grünen Knoten dagegen nicht. Die Deletion orangefarbener Knoten führt zu verlangsamtem Wachstum der Hefen, der Ausfalleffekt der gelb dargestellten Proteine ist unbekannt 120, 134 (Die Abbildung wurde aus Jeong et.al. übernommen).
Da im Pathogen-Wirt Screen YopM eine Vielzahl von Interaktionen mit Wirtsproteinen hatte, kann es als Hub im Pathogen-Wirts-Netzwerk betrachtet werden. Durch das gezielte Aus-schalten von YopM verliert Y. enterocolitica an Virulenz: Die YopM Deletionsmutante ist in Ih-rer Virulenz stark attenuiert und nicht fähig, Leber und Milz von Mäusen zu besiedeln 75. Wei-tere bioinformatische Analysen könnten zeigen, ob die Eliminierung von YopM ausreicht, da-mit sich die Pfadlänge im Pathogen-Wirt-PPI-Netzwerk verändert. Auch das Effektorprotein YopO ist sowohl im Pathogen-Wirt als auch im intrapathogenen Netzwerk ein Hub. YopO greift das Zytoskelett der Wirtszelle an und führt zur Depolymerisierung des Aktinzytoskeletts.
YopO verhindert Modifikationen des Zytoskeletts der Hefe und wirkt dadurch zytotoxisch 163. Nichtdestotrotz ist eine Yersinia YopO Deletionsmutante aber weiterhin im Mausmodell letal
das Aktinzytoskelett der Wirtszelle angreifen und dadurch die Funktion von YopO komplemen-tieren. Die anhand der Netzwerke ermittelten Daten können also helfen, Angriffsstellen für ei-ne Therapie gegen Y.enterocolitica zu identifizieren.
4.3.1 Erkenntnisse aus der Interpretation von Yersinia-Interaktions-daten
Im intrapathogenen Y2H-Screen wurden insgesamt 54 neue PPI von TTSS-Proteinen identifi-ziert. Die im Y2H-Screen gewonnene Daten, tragen dazu bei, die Struktur und den Aufbau des Yersinia TTSS besser zu verstehen, da die Bildung des Yersinia TTSS ein noch nicht voll-ständig untersuchter Prozess ist. Beispielsweise zeigen die intrapathogenen Y2H Daten, dass YopB, welches zusammen mit YopD und LcrV eine Translokationspore bildet 23, mit dem Chaperon SycH, dem Protein der inneren Membran LcrD und den TTSS-Proteinen YscD, YscJ und YscU interagiert. Die C-terminale Domäne von LcrD bindet seinerseits an SycH, auch YscJ interagiert mit YscU, sowie YscU mit YscD (Abb.29a). Das TTSS Protein YscD bil-det zusammen mit YscJ einen Ring in der inneren Membran des TTSS164 (Abb.29b). Mögli-cherweise interagieren alle diese Proteine während der Bildung des TTSS miteinander. Eine weitere Hypothese die aufgrund dieser Daten aufgestellt werden könnte, ist, dass der SycH-LcrD Proteinkomplex in Yersinien eine gate keeper Funktion besitzt und darüber entscheidet, welche Proteine zum Aufbau von TTSS benutzt und ins extrazelluläre Medium sezerniert wer-den. Im intrapathogenen Y2H-Screen zeigte das hypothetische Protein ORF73 Interaktionen sowohl mit Vollänge YadA als auch mit dem N-terminalen und C-teminalen Bereichen von Ya-dA. Auf dem pYV Plasmid sind die Chaperone der Effektorproteine in unmittelbarer Nähe zu den Effektorproteinen lokalisiert. Auch die kodierende Sequenz von ORF73 liegt in der Nähe von YadA. Man könnte deshalb die hypothese aufstellen, dass ORF73 ein Chaperon von Yad A ist. Die funktionelle Bedeutung dieser und anderen neuen Yersinia pYV Interaktionen kön-nen also in weiteren Assays näher untersucht werden.
YopB
SycH LcrD
YscJ YscU YscD
YscU YopB SycH
IM OM
LcrD YscD
YscJ
PM
YscU YopB SycH
IM OM
LcrD YscD
YscJ
PM
(b) (a)
gate keeper Funktion?
YopB
SycH LcrD
YscJ YscU YscD
YopB
SycH LcrD
YscJ YscU YscD
YscU YopB SycH
IM OM
LcrD YscD
YscJ
PM
YscU YopB SycH
IM OM
LcrD YscD
YscJ
PM
(b) (a)
gate keeper Funktion?
Abbildung 29: Abgeleitete Hypothesen zur Struktur und Aufbau des Yersinia TTSS. (a) Interaktionen der TTSS Proteine miteinander im intrapathogenen Y2H-Screen. (b) Das Model der Interaktionen der TTSS Proteine miteinander bei der Bildung von TTSS. Das Model ba-siert auf in Y2H gefundenen und durch Affinitätsreinigung detektierten Daten 164