PKN1
3.8 Aktivierung des IFN-ß-Promotors durch YopO
Das Yersinia Effektorprotein YopO ist eine Serin–Threonin-Kinase, die für die Virulenz von Y. ente-rocolitica eine wichtige Rolle spielt. Die Aktivierung von YopO erfolgt durch die Ausbildung eines 1:1 Komplexes mit G-Aktin 144. Die Interaktionspartner von YopO, die im Y2H-Screen identifiziert wur-den, schließen einige schon bekannte Interaktionen von YopO ein, wie zum Beispiel Interaktionen mit den kleinen GTPasen RhoA, RhoC, Rac1 und Rac2. Interessanterweise wurde im Pathogen-Wirt Y2H-Screen die tank binding kinase 1 (TBK1) als YopO-Interaktionspartner identifiziert. TBK1 stellt eine wesentliche Komponente der TLR-3 und TRL-4 vermittelten Typ 1 Interferon Induktion durch bakterielle Lipopolysaccharide dar und ist somit ein zentraler Regulator der Interferon Expres-sion. TBK1 phosphoryliert die Transkriptionsfaktoren IRF-3 und IRF-7 im Zytoplasma. Phosphory-lierte IRFs translozieren in den Zellkern und führen zur IFN Produktion 92. Die YopO-TBK1 Interakti-on wurde auch mittels LUMIER Bindungsassay bestätigt. Dafür wurden die kodierenden Sequenzen
dest30-ntPrA- und pcDNA-Rluc-Vektoren kloniert und zur transienten Expression in HEK 293 Zellen transfiziert. Zur Bestimmung der Luziferaseaktivität wurde 40 h nach der Transfektion Zelllysate hergestellt und für den LUMIER Bindungsassay verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Voll-länge YopO und dessen Aktin-Bindedomäne (A) im LUMIER Bindungsassay mit TBK1 interagierten.
Die Bindung zwischen YopO (Aktin-Bindedomäne) und TBK1 ist jedoch schwächer als mit Volllänge YopO. Dessen Kinasedomäne (KD) zeigt dagegen keine Interaktion mit TBK1. Übereinstimmend mit den Ergebnissen des Y2H-Screens war also die Aktin-Bindedomäne von YopO (aa 524-730) für die Interaktion mit TBK1 im LUMIER Assay ausreichend (Abb. 22b). Die Y2H-Ergebnisse des Volllänge YopO und einzelner Domänen sind nicht im Detail aufgeführt, sondern unter YopO kollektiv zusam-mengefasst und im Anhang Tab.2 dargestellt.
0 0,5
1 1,5
2 2,5 3,5
FOS JUN TBK1
YopO (A)
TBK1
YopO (wt) TBK1 YopO (K)
z-score
(a)
(b)
3
K R
K A
AD KM RM RA
wt YopO
x
x
N C
0 0,5
1 1,5
2 2,5 3,5
FOS JUN TBK1
YopO (A)
TBK1
YopO (wt) TBK1 YopO (K)
z-score
(a)
(b)
3
K R
K A
AD KM RM RA
wt YopO
x
x
N C
Abbildung 22: YopO und die Aktin-Bindedomäne von YopO interagieren mit TBK1 im LUMIER Bindungsassay. (a) Schematische Darstellung der Domänen, klonierten Bereiche und Mutanten von YopO. Kinasedomäne (K), Rac- und Aktin-Bindedomäne (RA), Aktin-Bindedomäne (A), Kina-seausfall- und Rac-Bindundsmutanten (KM) und (RM) und das Volllänge YopO wurden in LUMIER-bzw. in pCR3-Vektoren überexprimiert. (b) Die Interaktionen des Volllänge YopO und dessen Aktin-Bindedomäne bzw. Kinasedomäne mit TBK1 wurde mittels LUMIER Bindungsassay getestet. Die FOS-JUN Interaktion stellt eine Positivkontrolle dar.
Um die funktionelle Bedeutung der YopO-TBK1 Interaktion zu untersuchen, wurde der Einfluss beider Proteine auf die Aktivierung eines IRF3/IRF7-abhängigen Promotors untersucht. Dafür wurde p125luc als Reporterplasmid verwendet. Dabei handelt es sich um ein Plasmid, welches das Luziferase-Gen unter der Kontrolle des Interferon-ß-Promotors enthält. Die Aktivität des Genprodukts der Luziferase kann in einem Dual-Luziferase Assay gemessen werden. HEK 293 Zellen wurden mit den Plasmiden p125luc, YopO-pCR3 und TBK1-pCR3 kotransfiziert, 20 h inkubiert, und anschließend lysiert. Die Luziferaseaktivität des Zelllysats wurde dann mittels Dual-Luziferase Assay gemessen. Während beide Proteine allein einen schwach stimulierenden Effekt auf den IRF3/IRF7 abhängigen Promotor haben (Abb.23a,b) führt die Koexpression bei-der Proteine zu einer stark synergistischen Aktivierung des IFN-ß-Promotors. Als nächstes wurde untersucht, ob die Aktivierung des IFN-ß-Promotors spezifisch für YopO war. Dafür wur-den auch die anderen Yersinia Effektorproteine, nämlich YopM, YopH, YopP, YopE und YopT auf Promotoraktivierung untersucht. Keiner der fünf Effektoren war in der Lage, den IFN-ß-Promotor annähernd so stark zu aktivieren wie YopO (Abb.23a). Diese Experimente zeigen, dass YopO der einzige Yersinia Effektor ist, der im Zusammenspiel mit TBK1 zur Aktivierung des IFN-ß-Promotors führt.
Um zu bestimmen, welche Domäne von YopO zur Aktivierung des IFN-ß-Promotors beiträgt, wur-den unterschiedliche pCR3-Vektoren generiert, die entweder die YopO Kinasedomäne (K), die Rac-und Aktin-Bindedomäne (RA) oder die Aktin-Bindedomäne (A) alleine kodierten. Diese Konstrukte wurden in HEK 293 Zellen mit dem TBK1-kodierenden Plasmid kotransfiziert und nach 20 h Inkuba-tion die Aktivierung des IFN-ß Promotors mittels Dual-Luziferase Assay getestet. Die Abb.23b zeigt, dass die IFN-ß-Aktivierung verschwand, wenn ein nicht interagierendes Fragment von YopO, näm-lich die Kinasedomäne mit TBK1 koexprimiert war, und stark attenuiert, wenn die Bindedomäne in HEK 293 mit TBK1 koexprimiert war. Auch die Koexpression von Rac-und Aktin-Bindedomäne mit TBK1 konnte keine Aktivierung von IFN-ß hervorrufen. Die effektive Aktivierung des IFN-ß-Promotors erfordert demnach das Zusammenwirken der einzelnen Domänen von YopO.
Die nächsten Fragen waren, ob einerseits die Kinaseaktivität des YopO notwendig ist, um den IFN-ß-Promoter zu aktivieren, und andererseits, in wiefern die Rac1-Bindeaktivität die Aktivierung des IFN-Promotors beeinflusst. Dafür wurden pCR3-Vektoren generiert, die eine Kinaseausfallmutante (KM) (YopO/D268A/KDM)-kinase death mutant) 145, und eine Rac-Bindungsmutante (RM) mit den Mutationen Y591A, N595A, E599A in der Rac-Bindungsstelle 146 kodierten. Die Mutationen in der Rac-Bindungsstelle beeinträchtigen die Bildung eines Komplexes mit Rac1 und RhoA. Die Rac1-Bindedomäne von YopO imitiert den in Wirtszellen vorkommenden Guaninnukleotid-Dissoziations-Inhibitor (GDI) der Rho-GTPasen und inhibiert dadurch den Nukleotid-Austausch in Rac1 und RhoA.
Die Mutationen in der Rac-Bindedomäne heben deren Aktivität in vitro auf und beeinträchtigen da-durch die YopO-induzierte Zytoskelettzerstörung in vivo. Y. pseudotuberculosis Mutanten, denen die YpkA GDI-Aktivität fehlte, waren in ihrer Virulenz im Maus-Infektionsassay stark attenuiert 146. Bei
Aktivierung des IFN-ß-Promotors. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kinaseaktivität von YopO und damit vermutlich die Phosphorylierung von TBK1 essentiell für die Aktivierung des IFN-ß-Promotors ist. Im Gegensatz zur Kinaseausfallmutante konnte Rac-Bindungsmutante den IFN-ß-Promotor aktivieren. Der Effekt der IFN-ß-Aktivierung durch Rac-Bindungsmutante war jedoch deutlich schwächer als beim Wildtyp YopO. Vermutlich trägt auch die Rac1-Bindeaktivität zur IFN-ß-Aktivierung bei, jedoch scheinen die Kinase- und Aktin-Bindeaktivität von YopO die entscheidende Rolle bei der IFN-ß-Aktivierung zu spielen.
(a)
0 2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO luciferaseactivity
p125luc TBK1
0 2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO 0
2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO luciferaseactivity
p125luc TBK1
*
LuziferaseAktivität
YopM YopP YopH YopE YopT YopO
+ + + + +
+ +
-TBK1 Effektorproteine
IFN-β
0 2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO luciferaseactivity
p125luc TBK1
0 2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO 0
2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO luciferaseactivity
p125luc TBK1
0 2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO 0
2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO luciferaseactivity
p125luc TBK1
0 2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO 0
2 4 6 8 10 12 14
+ + + + + + + +
- + + + + + + +
YopM YopH YopP YopE YopT YopO luciferaseactivity
p125luc TBK1
*
LuziferaseAktivität
YopM YopP YopH YopE YopT YopO
+ + + + +
+ +
-TBK1
Effektorproteine YopM YopP YopH YopE YopT YopO
+ + + + +
+ +
-TBK1 Effektorproteine
IFN-β
(b)
10 15 20 25 30 35 40
0 5
0 10 15 20 25 30 35
40
*
*
45
wt
*
-TBK1 - - + + + + + +
wt - K RA A KM RM
LuziferaseAktivität
+ YopO
IFN-β
10 15 20 25 30 35 40
0 5
0 10 15 20 25 30 35
40
*
*
45
wt
*
-TBK1 - - + + + + + +
TBK1 - - + + + + + +
wt - K RA A KM RM
LuziferaseAktivität
+ YopO
IFN-β
Abbildung 23: Aktivierung des IFN-ß-Promotors durch YopO. (a) HEK 293 Zellen wurden mit dem Reporterplasmid p125luc, dem TBK1-kodierenden Plasmid sowie Plasmiden kotransfiziert, die die Yersinia Effektorproteine YopM, YopH, YopP, YopE, YopT und YopO kodierten (b) Alternativ wurden das Reporterplasmid p125luc, das TBK1-kodierende Plasmid sowie Plasmide, die das Voll-länge YopO, die Kinasedomäne (K), die Rac-und Bindedomänen (RA) bzw. die Aktin-Bindedomäne (A), oder die Kinaseausfallmutante (KM) bzw. die Rac-Bindungsmutante (RM) kodier-ten in HEK 293 Zellen kotransfiziert. Die Zellen wurden dann 20 h inkubiert, anschließend lysiert und die Luziferaseaktivität mittels Dual-Luziferase Assay gemessen. Y-Achse zeigt x-fache Aktivierung, normalisiert auf die Negativkontrolle.
* p<0,05