teinen von Y. enterocolitica
3.4 Identifikation und Charakterisierung von PPI zwischen Yer- Yer-sinia pYV und Wirtsproteinen
Zur Identifikation von Wirtsproteinen, die bei der Infektion mit Y. enterocolitica eine Rolle spielen, wurde ein Y2H-Screen durchgeführt. Um festzustellen, ob ein bestimmtes Bait-Protein autoaktivie-rende Eigenschaften besitzt und um die für den Screen geeignete 3-AT Konzentration zu
bestim-Netzwerkpatameter Y. e.
Knotengrad 6,70 Knotengrad (ohne Selbstinter
aktionen) 6,30
power Koeffizient γ 0,83
Pfadlänge 2,50 Clustering Koeffizient 0,30
(b) (c)
YscN, wurden im Prescreen-Verfahren erkannt und aus dem Screen ausgeschlossen. Für den ei-gentlichen Screen nach Pathogen-Wirt Interaktionen der 74 pYV-kodierten Y. enterocolitica Protei-ne, die als Baits vorlagen, wurden vier humane cDNA Genbanken verwendet: Dazu zählen eine Lymphknoten cDNA Genbank, eine Hoden cDNA Genbank sowie 2 Genbanken aus 5000 humanen und 12.381 cDNA Klonen. Mit Hilfe eines automatisierten Y2H Systems wurden mehr als 200 Screens durchgeführt und anschließend 2765 Preyinteraktionen sequenziert und analysiert (Abb.16). Um die potentiell relevanten Interaktionspaare zu selektieren, wurden aus den onsdaten zunächst alle Fragmente, die im 3’ UTR anfingen, entfernt. Dasselbe galt für alle Interakti-onen, die im 5’ UTR Stopcodons enthielten. Promiskuitive Preys, die an mehr als 5 unterschiedliche Baits binden, wurden entfernt. Interaktionen, die mehr als einmal vorkamen, wurden als high confi-dence definiert. Die nur einmal gefundenen Interaktionen wurden als low conficonfi-dence definiert. Im Screeningansatz wurden insgesamt 762 Interaktionen mit 40 unterschiedlichen pYV-kodierten Pro-teinen detektiert. 157 Interaktionen wurden als high confidence definiert. Die restlichen 605, nur einmal detektierten Interaktionen stellen das low confidence Set der Interaktionen dar.
762 unterschiedliche Interaktionspaare
74 pYV Gene
97 Baits: 72 ORFs + 24 ORF Fragmente + .Mutanten
2765 Prey
Interaktore wurden sequenziert
157 high confidence Set
762 unterschiedliche Interaktionspaare
74 pYV Gene
97 Baits: 72 ORFs + 23 ORF Fragmente + 2 Mutanten
>200
2765
Prey-Interaktoren wurden sequenziert
157 high confidence Set
762 unterschiedliche Interaktionspaare
74 pYV Gene
97 Baits: 72 ORFs + 24 ORF Fragmente + .Mutanten
2765 Prey
Interaktore wurden sequenziert
157 high confidence Set
762 Interaktionen 74 pYV Gene
97 Baits:
72 ORFs + 23 ORF Fragmente + 2 Mutanten
Screens
2765
Prey-Interaktoren wurden sequenziert
157 high confidence Interaktionen 762 unterschiedliche
Interaktionspaare 74 pYV Gene
97 Baits: 72 ORFs + 24 ORF Fragmente + .Mutanten
2765 Prey
Interaktore wurden sequenziert
157 high confidence Set
762 unterschiedliche Interaktionspaare
74 pYV Gene
97 Baits: 72 ORFs + 23 ORF Fragmente + 2 Mutanten
>200
2765
Prey-Interaktoren wurden sequenziert
157 high confidence Set
762 unterschiedliche Interaktionspaare
74 pYV Gene
97 Baits: 72 ORFs + 24 ORF Fragmente + .Mutanten
2765 Prey
Interaktore wurden sequenziert
157 high confidence Set
762 Interaktionen 74 pYV Gene
97 Baits:
72 ORFs + 23 ORF Fragmente + 2 Mutanten
Screens
2765
Prey-Interaktoren wurden sequenziert
157 high confidence Interaktionen
Abbildung 16: Identifikation von PPI zwischen Yersinia pYV Proteinen und Wirtsprotei-nen mittels automatisiertem Y2H-Screen. Das pYV-Plasmid von Y. enterocolitica kodiert für 74 ORFs. Mittels Gateway Klonierung wurden insgesamt 97 Bait-Plasmide hergestellt. Es wur-den mehr als 200 Screens durchgeführt und anschließend 2.765 Prey-Interaktoren sequenziert und analysiert. Im Selektionsverfahren wurden insgesamt 762 unterschiedliche Interaktionen identifiziert. 157 Interaktionen wurden als hochkonfident definiert.
Die detektierten Pathogen-Wirt Interaktionen sind im Anhang in Tabelle 2 dargestellt. Yersinia Proteine, die hauptsächlich am Aufbau des TTSS beteiligt sind, beispielsweise YscP, YscQ, YscT, VirG, YscB, YscF, YscJ und YscK, haben keine Interaktionen mit Wirtsproteinen gezeigt, wogegen sezernierte Proteine eine Anreicherung an Wirtszell-Interaktionen zeigen. Um den Deckungsgrad des durchgeführten Y2H-Screens zu bestimmen, wurde eine Text-Mining-Analyse für Yersinia-Wirtszell-Interaktionen durchgeführt. Dazu wurden 6429 Abstracts von Publikationen auf das Auftreten von humanen targets von Yersinia Proteinen gescreent. Dies erfolgte mit Hilfe des Text Mining Programms Syngrep. Sowohl die im high confidence als auch die im kompletten Datenset identifizierte Proteine werden statistisch signifikant im PubMed Abstracts im Kontext von Y.enterocolitica genannt (high confidence Set 12/158=7,6%, komplet-ter Datenset 36/597=6%). Die gefundenen Pathogen-Wirt Inkomplet-teraktionen wurden mit Yersinia-Proteininteraktionen zu einem Netzwerk verknüpft, welches dann charakterisiert wurde (Abb.17). Das Yersinia-Wirt Interaktionsnetzwerk hat zwei entscheidende Eigenschaften: (i) Proteine des TTSS interagieren hauptsächlich miteinander, (ii) während sekretierte Yersinia Proteine eine Anreicherung für Interaktionen mit Wirtsproteinen zeigen (Abb.16b). Für Patho-gen-Wirt und intrapathogene Interaktionen konnte keine Gradverteilung ermittelt werden. Der Grund dafür war der Mangel an Proteinen in den Protein-Protein-Interaktionsdaten135. Es konn-te jedoch gezeigt werden, dass pathogen-kodierkonn-te Prokonn-teine hauptsächlich mit Prokonn-teinen inkonn-ter- inter-agieren, die im Wirtszellinteraktom zentral angeordnet sind 139. Die Ergebnisse des Yersinia-Screens zeigen, dass Grad und betweenness Zentralität für zelluläre Targets von Y. enterocoli-tica bedeutend ansteigen. Dies gibt einen Hinweis darauf, dass Y. enterocolienterocoli-tica eng vernetzte und zentrale Proteine im zellulären Netzwerk angreift.
Orf73
YopT
YscE
YopP YopM
YopE YopB Orf155
YscY
YopN
YopO
YscM2 YscO yomA
Orf81
yscA lcrD
YersiniapYV Wirt
Orf73
YopT
YscE
YopP YopM
YopE YopB Orf155
YscY
YopN
YopO
YscM2 YscO yomA
Orf81
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YersiniapYV Wirt
Orf73
YopT
YscE
YopP YopM
YopE YopB Orf155
YscY
YopN
YopO
YscM2 YscO yomA
Orf81
yscA lcrD
YersiniapYV Wirt
Yersinia-hostdegree
b c
d
Durchschnittan Interaktionen
k
N(k)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
DurchschnittlicheGrad Zentralität
Interaktore -Andere Proteine
+ +
-- + +
-0.000000 0.000050 0.000100 0.000150 0.000200 0.000250 0.000300 0.000350 0.000400 0.000450 0.000500 Zentralität Durchschnittlichebetweenness Intrapathogen Pathogen-Wirt
TTSS Sekretierte Effektoren Andere Unbekannt
Intrapathogene- Yersinia-Wirt-Interaktionen
Yersinia-hostdegree
b c
d
Durchschnittan Interaktionen
k
N(k)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
DurchschnittlicheGrad Zentralität
Interaktore -Andere Proteine
+ +
-- + +
-0.000000 0.000050 0.000100 0.000150 0.000200 0.000250 0.000300 0.000350 0.000400 0.000450 0.000500 Zentralität Durchschnittlichebetweenness Intrapathogen Pathogen-Wirt
TTSS Sekretierte Effektoren Andere Unbekannt
Intrapathogene- Yersinia-Wirt-Interaktionen
Yersinia-hostdegree
b c
d
Durchschnittan Interaktionen
k
N(k)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
DurchschnittlicheGrad Zentralität
Interaktore -Andere Proteine
+ +
-- + +
-0.000000 0.000050 0.000100 0.000150 0.000200 0.000250 0.000300 0.000350 0.000400 0.000450 0.000500 Zentralität Durchschnittlichebetweenness Intrapathogen Pathogen-Wirt
TTSS Sekretierte Effektoren Andere Unbekannt
Intrapathogene- Yersinia-Wirt-Interaktionen
Yersinia-hostdegree
b c
d
Durchschnittan Interaktionen
k
N(k)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
DurchschnittlicheGrad Zentralität
Interaktore -Andere Proteine
+ +
-- + +
-0.000000 0.000050 0.000100 0.000150 0.000200 0.000250 0.000300 0.000350 0.000400 0.000450 0.000500 Zentralität Durchschnittlichebetweenness Intrapathogen Pathogen-Wirt
TTSS Sekretierte Effektoren Andere Unbekannt
Intrapathogene- Yersinia-Wirt-Interaktionen
Abbildung 17: Charakterisierung von PPI zwischen Yersinia pYV-kodierten und Wirtsprotei-nen (a) Interaktionsnetzwerk zwischen Yersinia pYV und Wirtsproteinen. Die bakteriellen Proteine sind im vorliegenden Netzwerk grün und deren direkte Interaktionspartner rot dargestellt. (b) ne des TTSS, sezernierte Proteine, Effektorproteine, Proteine mit diversen Funktionen sowie Protei-ne mit unbekannter Funktion, die an intrapathogeProtei-nen oder Pathogen-Wirt InteraktioProtei-nen teilProtei-nehmen.
(c) Gradverteilung der Knoten: Der Anzahl an Interaktionen, die ein Protein eingeht (k), wird auf der y-Achse der entsprechende Anteil an Proteinen zugeordnet (N(k)). (d) Grad und betweenness Zent-ralität von zellulären Interaktoren im Vergleich zu anderen Proteinen.
Mit den im Y2H-Screen gewonnenen Yersinia-Wirts-Interaktionen wurde eine Gene Ontology (GO) Term-Analyse unter Benutzung des functional annotation tool von David (Database for Annotation, Visualisation and Integration Discovery, http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) durchgeführt. Ziel war es, mittels Anwendung der GO Term-Analyse, die gewonnenen Interaktoren bestimmten funkti-onellen Klassen zuzuordnen. Für die Analyse wurden als erstes die high confidence Y2H-Interaktionen verwendet. Um den auszuwertenden Datensatz zu vergrößern, wurden außer high confidence Interaktoren auch Wirtszellproteine verwendet, die mit einem Bait eine indirekte Interak-tion eingingen, mit anderen Worten, Wirtszellproteine, die mit 2 Preys eines Yersinia-Baits interagie-ren und dieses damit funktionell verknüpfen. Diese PPI-Daten wurden dem BioGRID http://www.thebiogrid.org/downloads.php entnommen. Die GO Term-Analyse zeigte, dass die Pa-thogen-Wirt-Interaktionsdaten mit Proteinen angereichert sind, die an der Regulation der
Transkrip-toskeletts und posttranslationellen Modifikationen funktionell beteiligt sind (Abb.18). Eine Anreiche-rung an Interaktionen mit Wirtsproteinen, die mit den oben erwähnten Prozessen assoziiert sind, zeigten insbesondere die Yersinia Proteine YopO, YopM, YopP, YopN, YopB sowie YscE und YscM2. Aus den PPI-Daten wird ersichtlich, dass jeder Signalweg durch mehrere Yersinia-Proteine angegriffen werden kann (Anhang Tab.2).
0 2 4 6 8 10 12 14
Trans kription Zytos kelett Post-translationale Modifikationen
Signalling Apoptose
-log(p) (Benjamini)
Abbildung 18: Funktionelle Analyse der Pathogen-Wirt Interaktionen. Die Pathogen-Wirt-Interaktionsdaten sind mit Proteinen angereichert, die an der Regulation der Transkription, Organi-sation des Zytoskeletts sowie an posttranslationellen Modifikationen und der Signaltransduktion funktionell beteiligt sind.