Zur Untersuchung der Funktion bisher nicht charakterisierter Yersinia pYV Proteine wurde zunächst eine Klonkollektion hergestellt, die aus Entry- und Y2H-Vektoren mit je einem Y. enterocolitica Gen oder einem Genfragment zusammengesetzt ist. Diese Klonkollektion wurde einerseits zur Identifika-tion von Wirtsproteinen, die bei der InfekIdentifika-tion mit Y. enterocolitica eine Rolle spielen verwendet und andererseits zur Identifikation von PPI zwischen pYV Proteinen.
Die identifizierten PPI wurden anschließend bioinformatisch analysiert. Mit den im Y2H-Screen gewonnenen Yersinia-Wirts-Interaktionen wurde eine funktionelle Analyse durchgeführt. Anschlie-ßend erfolgte die Validierung einiger Interaktionspaare mittels LUMIER Bindungsassays. Die biolo-gische und funktionelle Relevanz einiger identifizierter PPI wurde mittels funktionellen Assays weiter untersucht.
Proteininteraktionen zwischen pYV Proteinen
Kollaboration mit P. Uetz FZ Karlsruhe
Pathogen-Wirt Proteininteraktionen
Kollaboration mit M. Koegl DKFZ Heidelberg
Funktionelle Experimente Herstellung einer
Yersinia pYV Klonkollektion
Bioinformatische Auswertung
Kollaboration mit R. Zimmer LMU München und M. Koegl
DKFZ Heidelberg
Proteininteraktionen zwischen pYV Proteinen
Kollaboration mit P. Uetz FZ Karlsruhe
Pathogen-Wirt Proteininteraktionen
Kollaboration mit M. Koegl DKFZ Heidelberg
Funktionelle Experimente Herstellung einer
Yersinia pYV Klonkollektion
Bioinformatische Auswertung
Kollaboration mit R. Zimmer LMU München und M. Koegl
DKFZ Heidelberg
Pathogen-Wirt Proteininteraktionen
Kollaboration mit M. Koegl DKFZ Heidelberg
Funktionelle Experimente Herstellung einer
Yersinia pYV Klonkollektion
Bioinformatische Auswertung
Kollaboration mit R. Zimmer LMU München und M. Koegl
DKFZ Heidelberg
Abbildung 13: Analyse der PPI von Y. enterocolitica. Flussdiagramm zum Ablauf der durchge-führten Arbeiten.
3.1 Herstellung einer Y. enterocolitica Entryvektor Klonkollekti-on
Zur funktionellen Analyse der pYV Proteine von Y. enterocolitica wurde zunächst eine Klonkollektion hergestellt, die aus Vektoren mit je einem Y. enterocolitica-Gen oder einem Genfragment zusam-mengesetzt ist (Tab. 5). Dafür wurden die ORFs aus dem Virulenzplasmid von Y. enterocolitica pYVa127/90 mittels nested PCR amplifiziert und dabei att sites angefügt. Für Transmembranprotei-ne wurden Proteinfragmente ohTransmembranprotei-ne TransmembrandomäTransmembranprotei-ne erstellt. Der Grund dafür war, dass Prote-ine mit hydrophoben Bereichen an Transmembrandomänen nicht in den Nukleus transloziert wer-den können und zu unspezifischen hydrophoben Wechselwirkungen führen können. Insgesamt wurden 74 ORFs und 23 Genfragmente, die im Virulenz-Plasmid von Y. enterocolitica kodiert sind, amplifiziert und kloniert.. Die kodierende Sequenz für ORF77 und RepB konnte nicht in den Entry-vektor kloniert werden. Ausgehend von der EntryEntry-vektor Klonkollektion wurden alle pYV Gene in Y2H Bait und Prey-Vektoren kloniert (Tab.5).
Tabelle 12: Übersicht über die in den Entryvektor klonierten und Sequenzverifizierten Y. ente-rocolitica pYV ORFs
97 Summe
2 In pDONR207 klonierte Proteine mit Mutation in der katalytischen Domäne
23 In pDONR207 klonierte ORF-Fragmente von Transmembran - und
Effektorproteinen
72 In pDONR207 klonierte ORFs voller Länge
74 Anzahl der ORFs
70 kb Größe des Virulenz-Plasmids von Y. enterocolitica (O:9) pYVa127/90
97 Summe
2 In pDONR207 klonierte Proteine mit Mutation in der katalytischen Domäne
23 In pDONR207 klonierte ORF-Fragmente von Transmembran - und
Effektorproteinen
72 In pDONR207 klonierte ORFs voller Länge
74 Anzahl der ORFs
70 kb Größe des Virulenz-Plasmids von Y. enterocolitica (O:9) pYVa127/90
3.2 Identifikation von intrabakteriellen PPI
Zur Identifikation von Proteininteraktionen zwischen pYV Proteinen wurden in Tab. 5 aufgeführten Bait-Plasmide (pGBKT7) in den haploiden Hefestamm Y187 (Mating type a) und Prey-Plasmide in den Hefestamm AH109 (Mating type α) transformiert. Im Vorfeld des Screens wurde die Zahl der Baitinteraktionen bestimmt, um dadurch autoaktivierende Bait-Proteine zu identifizieren. Die Zahl der Baitinteraktionen zeigt, wie oft das jeweilige Bait Fusionsprotein insgesamt eine positive Interak-tion eingeht. Um autoaktivierende Bait-Proteine zu identifizieren, wurden alle Hefen mit Bait-Plasmiden mit einem Hefestamm gepaart, der das leere Prey-Plasmid pGADT7 enthielt. Die diploi-den Hefen wurdiploi-den dann auf Reporterselektionsmedium mit unterschiedlichen Konzentrationen des
rung, die durch maximal 10mM 3-AT unterdrückt werden konnten, wurden anschließend unter ent-sprechenden Selektionsbedingungen im Y2H System untersucht. Im Falle von YscD (aa1-129) konnte die Selbstaktivierung erst bei einer 3-AT Konzentration von 25 mM unterdrückt werden.
Dieses Bait wurde trotzdem für die weitere Y2H-Analyse verwendet. Im Falle des YopD Chaperons SycD konnte die Selbstaktivierung erst durch 75 mM 3-AT unterdrückt werden, weshalb dieses Protein vom weiteren Y2H-Screen ausgeschlossen wurde. Autoaktivierende Prey-Proteine wurden erst im Anschluss an den Screen identifiziert. Die Zahl der Preyinteraktionen wird als Maß für die Autoaktivierung durch bestimmte Preys verwendet und gibt an, wie oft das jeweilige Prey-Fusionsprotein insgesamt eine positive Interaktion gezeigt hat. Wenn ein Prey-Protein eine wesent-lich höhere Zahl an Interaktionen hat als die Mehrheit der übrigen Preys, handelt es sich um eine unspezifische Aktivierung. In unseren Analysen war die höchste Zahl an Interaktionen mit dem Bait 13, und die höchste Zahl an Interaktionen mit dem Prey 25. Für den Screen wurden die verschiede-nen Bait- und Prey-Plasmid tragenden Hefen gepaart und zum Test auf Interaktion der rekombinant-exprimierten Y. enterocolitica Fusionsproteine vierfach auf Reporterplatten aufgetragen. Das Wachstum der Hefen auf diesen Platten weist auf eine bestehende Interaktion zwischen den getes-teten Proteinen hin. Eine Interaktion wurde dann als positiv bewertet, wenn mindestens 3 der jeweils vier ausplattierten Hefekolonien ein deutliches Wachstum zeigten. Die Ergebnisse des intrapatho-genen Y2H-Screens sind in Anhang Tab.1 dargestellt. Von insgesamt 72 im Y2H System untersuch-ten Y. enterocolitica Proteinen waren 65 Proteine eine Wechselwirkung eingegangen. Es wurden 225 unterschiedliche Interaktionen zwischen 65 Y. enterocolitica Proteinen bzw. verschiedenen Fragmenten detektiert. Außerdem wurden 13 Selbstinteraktionen, nämlich von YscU, YscI, YscJ, YopD, YscR, YscX, SycH und Orf73 identifiziert. Eine Literaturrecherche nach bereits veröffentlich-ten PPI (http://www.iimexconsortium.org, NCBI Pubmed) ergab, dass von den publizierveröffentlich-ten 80 Inter-aktionen zwischen TTSS Proteinen 26 InterInter-aktionen in unserem Y2H-Screen wiedergefunden wur-den (Abb.14). 53 der in der Literatur beschriebenen Interaktionen konnten durch diese Methode allerdings nicht wiedergefunden werden. Besonders hervorzuheben ist, dass insgesamt 54 neue PPI zwischen TTSS Proteinen identifiziert werden konnten. Mit dem von uns durchgeführten Y2H-Screen konnte somit eine solide Grundlage als Ausgangspunkt für weitere Analysen und Erkennt-nisse geschaffen werden. Es sind aber weitere Untersuchungen notwendig, um die einzelnen Inter-aktionen zu bestätigen und deren biologische Bedeutung aufzuklären.
(a)
Literatur
53 26 54
Hefe-2-Hybrid Literatur
53 26 54
Hefe-2-Hybrid (b)
ylp A yopB YopD sycD lcrV lcrG lcrR LcrD YscY YscX sycN tye A yopN yscN yscO yscP yscQ yscR yscS yscT yscU virG virF yscA yscB yscC yscD yscE yscF yscG yscH yscI yscJ yscK yscL yomA YscM1 sycH sycE orf155 orf73 YscM2
ylpA yopB YopD sycD lcrV lcrG lcrR LcrD YscY YscX sycN tyeA yopN yscN yscO yscP yscQ yscR yscS yscT yscU virG virF yscA yscB yscC yscD yscE yscF yscG yscH yscI yscJ yscK yscL yomA YscM1 sycH sycE orf155 orf 73 YscM2
Abbildung 14: PPI von Proteinen des TTSS von Y. enterocolitica. (a) Überlappung zwischen den in der Y2H-Analyse detektierten und den bereits veröffentlichten Interaktionen. Angegeben sind die absoluten Zahlen aus der Literatur und den Ergebnissen. (b) Übersicht über die im Y2H-Screen und in der Literaturrecherche gefundenen Interaktionen. Die bereits publizierten Interaktio-nen sind rot markiert, die publizierten InteraktioInteraktio-nen, die im Y2H-Screen nicht wiedergefunden wur-den, sind gelb markiert, orange markiert sind die Interaktionen, die im Y2H-Screen neu detektiert wurden.