Statistische Auswertung

Für die statistische Auswertung wurden die Programme „SigmaStat 2.0 for Windows®“ (Jandel Scientific Cooperation, San Rafael, CA, USA) und SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) genutzt. Die Ergebnisse aus dem Versuchen 1, 2 und 3 wurden auf Normalverteilung geprüft und mittels One-Way-ANOVA oder One-Way ANOVA on Ranks ausgewertet. Wurde eine One-Way ANOVA durchgeführt, so erfolgte die statistische Bewertung auf Signifikanz mittels des Tukey-Tests. Kamen bei nicht normal verteilten Daten eine One-Way ANOVA on Ranks zum Einsatz, so wurde für die Varianzanalyse ein Kruskal-Wallis-Test durchgeführt. Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen wurden bei einer Überschreitungswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 als signifikant angesehen.

Die Daten aus den Versuchen 4, 5, 6 und 7 wurden mit Hilfe eines gemischten linearen Modells (SAS Prozedur „mixed“) ausgewertet, um die wiederholten Messungen pro Ejakulat im Thermoresistenz (Zeit und Behandlung) zu berücksichtigen. Bulle, Behandlung und Zeit sowie deren Interaktion wurden als fixe Effekte in das Modell aufgenommen. Die Residuen waren normalverteilt (Tukey-Kramer Test). Der Einfluss eines Effektes wurde bei einer

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Überschreitungswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 als signifikant angesehen (SAS 9.2 Help and Documentation, SAS Institute Inc., Cary, NC, 2008).

Yijkl= µ + Bullei + Behandlungj + Zeitk + eijkl wobei

Yijkl = Beobachtungswert µ = Populationsmittel

Bullei = fixer Effekt des Bullen (i=1-4) Behandlungj = fixer Effekt der Behandlung (j=1-3) Zeitk = fixer Effekt der Zeit (k=1-3)

eijkl = zufälliger Restfehler

Bei allen Tabellen wurde der Mittelwert als und die Standardabweichung (±SD) angegeben.

49 4. Ergebnisse

4.1 Versuch 1: Verringerung der eingesetzten Spermienkonzentration zur Bestimmung des ATP-Gehaltes und der Einfluss auf die Motilität

Die Gesamtmotilität zeigte signifikante Abweichungen (p ≤ 0,05) zwischen den Verdünnungsstufen 20x10⁶ Spermien/ml und 5x10⁶ Spermien/ml und auch zwischen den Verdünnungen mit 10x10⁶ Spermien/ml und 5x10⁶ Spermien/ml, wobei die Motilität der höchsten Verdünnungsstufe am geringsten war. Die Motilität der auf 20x10⁶ Spermien/ml verdünnten Proben betrug 86,6 ± 4,2%, die Versuchsreihe der 10x10⁶ Spermien/ml wies eine Motilität von 81,8 ± 4,9% auf, die höchste Verdünnungsstufe von 5x10⁶ Spermien/ml besaß noch eine Motilität von 69,1 ± 13,1%.

Die Messung der Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien mittels CASA-Motilitätsanalyse zeigte, dass ein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen der Verdünnung mit 20x10⁶ Spermien/ml und der mit 5x10⁶ Spermien/ml bestand. Die Spermien in der 20x10⁶ /ml Verdünnung zeigten eine Vorwärtsbeweglichkeit von 81,5

± 3,5%, die Spermien in der 5x10⁶/ml Verdünnung nur eine 66,9 ± 12,6%ige vorwärts gerichtete Fortbewegung.

Für die ermittelte BCF konnten keine signifikanten Abweichungen zwischen den einzelnen Versuchsreihen festgestellt werden.

Das ALH stellte sich in der Verdünnung mit 5x10⁶ Spermien/ml signifikant geringer als bei 20x10⁶ Spermien/ml dar. Zwischen den anderen Versuchsgruppen gab es keine signifikanten Unterschiede.

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Die Messung des MMP mittels JC-1 ergab keine signifikanten Unterschiede. In allen Versuchsgruppen lag der Anteil Spermien mit einem hohen Membranpotential auf einem vergleichbaren Niveau.

Abbildung 4: ATP-Gehalte unterschiedlicher Spermienverdünnungsstufen

Wie Abbildung 4 zeigt, bestanden signifikante Unterschiede in den luminometrisch erfassten ATP-Gehalten der einzelnen Verdünnungsstufen. Die nachgewiesene ATP-Menge in der 20x10⁶ Spermien/ml Verdünnung (4,9 ± 1,6nM ATP-Gehalt) war sowohl zur Versuchsgruppe mit 10x10⁶ Spermien/ml (2,3 ± 0,5nM ATP-Gehalt), als auch zur Verdünnungsstufe mit 5x10⁶ Spermien/ml (1,0 ± 0,3nM ATP-Gehalt) signifikant abweichend (p ≤ 0,05). Zwischen der 10x10⁶ Spermien/ml Stufe und der höheren Verdünnung von 5x10⁶ Spermien/ml bestand kein signifikanter Unterschied.

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4.2 Versuch 2: Beeinträchtigung der ATP-Gehaltsbestimmung, der Messung des MMP und der Motilitätsparameter durch eidotterhaltige Verdünner

Die Motilitätsermittlung mittels CASA-System zeigte einen statistisch signifikanten Unterschied mit p ≤ 0,05 zwischen den Versuchsgruppen. Die Versuchsgruppe der 10x10⁶ Spermien/ml in Sexcess-Sample® hatten eine durchschnittliche Motilität von 81,8 ± 4,9%, wohingegen die Spermien im eidotterhaltigen Sexcess®-Verdünner eine Motilität von 94,1 ± 4,9% zeigten.

Die Untersuchung der Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien ergab keine signifikante Differenz. Sie betrug in der Versuchsgruppe mit Sexcess-Sample® 78,6 ± 4,2%, und in der Sexcess®-Gruppe waren 82,7 ± 3,7% vorwärtsbeweglich.

Eine statistische Auswertung der BCF ergab, dass diese in der Sexcess-Sample®-Verdünnung signifikant höher war als in der eidotterhaltigen Sexcess®-Sexcess-Sample®-Verdünnung.

Ebenso war die ALH signifikant höher in eidotterfreiem Medium als in eidotterhaltigem Verdünner, für beide Ergebnisse gilt p ≤ 0,05.

Die Ermittlung von Spermien mit einem hohen MMP anhand der Färbung mit JC-1 Farbstoff ergab, dass dieser Anteil im eidotterfreien Verdünner bei durchschnittlich 20,7 ± 6,4% lag. Im Sexcess®-Verdünner lag dieser Anteil signifikant niedriger bei nur 9,3 ± 3,1% (p ≤ 0,05).

Bei der Lumineszenzmessung des ATP-Gehaltes in den verschiedenen Versuchsgruppen konnte kein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt werden. Die Sexcess-Sample®-Versuchsgruppe zeigte einen mittleren ATP-Gehalt von 2,3 ± 0,5nM ATP/10x10⁶ Spermien pro ml, die Sexcess®-Versuchsgruppe hatte einen ATP-Gehalt von 2,2 ± 0,8nM ATP/10x10⁶ Spermien pro ml.

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4.3 Versuch 3: Einfluss des Hoechst 33342 Farbstoffes auf Motilität, MMP und ATP-Gehalt von Spermien

Die Messung der Gesamtmotilität der Versuchsgruppen mit und ohne Zusatz des Hoechst 33342 Farbstoffes mittels CASA ergab keinerlei signifikanten Unterschied.

Die Versuchsgruppe ohne Farbstoff hatte eine durchschnittliche Motilitätsrate von 50,7 ± 11,8%, von den Spermien mit Hoechst-Zusatz waren 48,2 ± 12,3% motil.

Auch die vorwärts gerichtete Bewegung der Spermien unterschied sich nicht signifikant. Die ungefärbten Spermien hatten einen Anteil von 48,6 ± 11,3% vorwärts beweglichen Spermien, in der angefärbten Versuchsgruppe waren 46,0 ± 12,7%

vorwärtsbeweglich.

Die statistische Auswertung der BCF-Frequenz zeigte, dass ein signifikanter Unterschied zwischen der gefärbten und der unbehandelten Versuchsgruppe bestand. Die mit Hoechst 33342 inkubierte Gruppe zeigte eine signifikant höhere (p ≤ 0,05) Frequenz von 37,8 ± 1,4Hz gegenüber der ungefärbten Versuchsreihe mit 35,5 ± 1,3Hz.

Bei der Auswertung der mittleren ALH konnte kein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt werden. Die unbehandelte Versuchsgruppe besaß eine ALH von 2,3 ± 0,3µm, die mit Hoechst inkubierten Spermien zeigten einen Kopfausschlag von 2,0 ± 0,2µm.

Die Bestimmung des Anteils von Spermien mit einem hohen MMP in den einzelnen Versuchsgruppen zeigte ebenfalls keinerlei signifikante Abweichung. Bei der Bestimmung des ATP-Gehaltes der Versuchsgruppen wurde in der unbehandelten Versuchsgruppe ein ATP-Gehalt von 1,7 ± 0,5nM ATP/10x10⁶ Spermien pro ml festgestellt, die Versuchsgruppe der Hoechst 33342 gefärbten Spermien wies ebenfalls einen ATP Gehalt von 1,7 ± 0,5 nM ATP/10x10⁶ Spermien pro ml auf (p = 0,80).

53

4.4 Versuch 4: Veränderung des ATP-Gehalts, des MMP, der Gesamtmotilität, der Vorwärtsbeweglichkeit, der BCF und der ALH nach geschlechtsspezifischer Sortierung der Spermien im Flowzytometer

In diesem Versuch wurden Ejakulate von 4 verschiedenen Bullen an insgesamt 18 Versuchstagen auf Gesamtmotiliät, Vorwärtsbeweglichkeit, BCF und ALH mittels CASA-Messung untersucht. Zusätzlich wurden eine Detektion des MMP mittels flowzytometrischer Messung des JC-1 Farbstoffes und eine Ermittlung des ATP-Gehaltes durch Lumineszenz-Messung nach null Stunden, drei Stunden und sechs Stunden im Thermoresistenztest durchgeführt.

Die statistische Auswertung ergab, dass die Motilität der unsortierten Spermien signifikant geringer als die der sortierten Spermien war. Dies zeigte sich zu allen drei Untersuchungszeitpunkten (p ≤ 0,001). Zusätzlich bestand ein signifikanter Unterschied in den beiden Versuchsgruppen zwischen der null Stunden Messung und der sechs Stunden Messung. Für die unbehandelten und die sortierten Spermien konnte ein signifikanter Abfall der Motilität während der 6 Stunden im Thermoresistenztest ermittelt werden (p ≤ 0,001) (Tabelle 3).

Tabelle 3: Gesamtmotilität der unsortierten und standardsortierten Versuchsgruppen in %

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Bei der Vorwärtsbeweglichkeit (Tabelle 4) konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Behandlungsgruppen ermittelt werden. Hier zeigte sich ein statistisch abgesicherter Unterschied nur über die Zeitdauer des Versuches, so dass die unbehandelten Spermien eine signifikant höhere Vorwärtsbeweglichkeit zur Stunde null aufwiesen (62,9 ± 12,1%), als sie es nach sechs Stunden Thermoresistenztest (39,9 ± 18,9%) hatten (p ≤ 0,001). Gleiches galt für die sortierte Behandlungsgruppe, bei der 66,8 ± 14,2% zu Beginn vorwärtsbeweglich waren, nach sechs Stunden Lagerung waren nur noch 46,7 ± 23,9% vorwärtsbeweglich (p ≤ 0,001). Der signifikante Abfall der Vorwärtsbeweglichkeit konnte auch zwischen der drei Stunden (60,7 ± 18,6%) und sechs Stunden Messung (46,7 ± 23,9%) nachgewiesen werden (p ≤ 0,05).

Tabelle 4: Vorwärtsbeweglichkeit der unsortierten und der standardsortierten Versuchsgruppen in %

Die BCF zeigte in dieser Versuchsreihe signifikante Abweichungen (Tabelle 5). Es konnte sowohl ein signifikanter Unterschied über die Zeitdauer als auch innerhalb der Zeitpunkte zwischen den Behandlungsgruppen ermittelt werden. So war die null Stunden Messung der unbehandelten Spermien (35,8 ± 2,5Hz) signifikant höher als die drei Stunden Messung (33,0 ± 3,0Hz) (p ≤ 0,05) und auch als die der sechs Stunden Messung (31,7 ± 2,5Hz) (p ≤ 0,001) unsortierter Spermien. Gleiches galt für die geschlechtsspezifisch sortierten Spermien mit einem null Stunden Wert von 27,7

55

± 3,1Hz und einem signifikant geringeren Wert mit p ≤ 0,05 und 24,8 ± 4,2Hz nach drei stündiger Messung und einem weiter abfallenden Wert zur sechs Stunden Messung von 23,2 ± 3,1Hz (p ≤ 0,001). Zusätzlich konnte auch ein statistisch abgesicherter Unterschied zwischen den beiden Behandlungsgruppen zu jedem Messzeitpunkt ermittelt werden (p ≤ 0,001).

Tabelle 5: BCF der unsortierten und der standardsortierten Versuchsgruppen in Hz

Wurde die ALH für beide Versuchsgruppen jeweils zu den drei Versuchszeitpunkten statistisch ausgewertet (Tabelle 6), so konnte nur ein signifikanter Unterschied mit p

≤ 0,001 zwischen den Behandlungsgruppen, jedoch nicht über den Zeitverlauf hinweg, ermittelt werden. So unterschieden sich die unbehandelten Spermien zu Beginn der Untersuchung (2,7 ± 0,6µm) nur signifikant zur Gruppe der sortierten Spermien (1,6 ± 0,6µm), jedoch nicht zur drei Stunden oder zur sechs Stunden Messung. Gleiches galt für die drei Stunden und die sechs Stunden Messung der ALH, welche nur zwischen den beiden Behandlungsgruppen signifikant abwich (p <

0,001), jedoch nicht über den Zeitverlauf.

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Tabelle 6: mittlere seitliche Kopfauslenkung der unsortierten und der standardsortierten Versuchsgruppen in µm

Die Messung des MMP erfolgte mittels Flowzytometrie und des Farbstoffes JC-1. Der Anteil Spermien mit einem hohen MMP lag bei den unbehandelten Spermien zur Stunde null bei 17,8 ± 12,9%, bei den sortierten waren es nur 8,2 ± 3,5%. Dieser Unterschied war signifikant (p ≤ 0,001) und konnte auch an den anderen beiden Messzeitpunkten (p ≤ 0,001) nachgewiesen werden. Im Zeitverlauf gab es keinen statistischen Unterschied in den jeweiligen Behandlungsgruppen, wie Tabelle 7 zeigt.

Tabelle 7: Anteil Spermien mit einem hohen MMP der unsortierten und der standardsortierten Versuchsgruppen in %

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Wurde der ATP-Gehalt mittels Lumineszenz gemessen, so zeigte sich, dass in der unbehandelten Gruppe ein signifikant (p ≤ 0,001) höherer Gehalt (2,5 ± 1,0nM ATP/10x10⁶ Spermien pro ml) gegenüber den sortierten Spermien zur Stunde null (1,4 ± 0,4nM ATP/10x10⁶ Spermien pro ml) vorlag (Tabelle 8). Dies galt aber nur für die null Stunden Messung, einen Einfluss der Lagerzeit konnte nur bei den unbehandelten Spermien nachgewiesen werden. So war der null Stunden Wert (2,5

± 1,0nM ATP/10x10⁶ Spermien pro ml) signifikant höher (p ≤ 0,05) zur drei Stunden Messung (1,8 ± 0,8nM ATP/10x10⁶ Spermien pro ml) und auch zur sechs Stunden Messung (1,7 ± 0,7nM ATP/10x10⁶ Spermien pro ml) (p ≤ 0,01). Zwischen der drei und sechs Stunden Messung der unbehandelten Spermien konnte kein signifikanter Abfall ermittelt werden.

Tabelle 8: ATP-Gehalt in nM ATP/10x10⁶ Spermien der unsortierten und der standardsortierten Versuchsgruppen pro ml

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4.5 Versuch 5: Einfluss der Deaktivierung des elektrostatischen Feldes während der geschlechtsspezifischen Differenzierung im Vergleich zu standardsortiertem und unbehandeltem Spermien

Es kamen Ejakulate von 2 Holstein-Friesian Bullen an sechs Versuchstagen zum Einsatz.

Wie in Tabelle 9 zu sehen, zeigte die Gesamtmotilität der Versuchsgruppe mit deaktiviertem elektrischen Feld keine signifikante Veränderung über den Zeitverlauf, wohin gegen sowohl die unter Standardbedingungen sortierten Spermien (p ≤ 0,01) als auch die unbehandelten Spermien (p ≤ 0,001) zwischen der null Stunden Messung und der sechs Stunden Messung einen signifikanten Abfall der Motilität zeigten. Zwischen den drei Versuchsgruppen zum jeweiligen Versuchszeitpunkt konnte nur zwischen der unbehandelten Versuchsgruppe und dem normal sortierten Spermien ein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Die Messung der Motilität der unbehandelten Spermien ergab zur Stunde null 59,8 ± 15,1%, wohin gegen die sortierten Spermien eine Gesamtmotilität von 80,5 ± 8,4% hatten. Dieser Unterschied war statistisch signifikant mit p ≤ 0,05. Diese signifikante Differenz wurde auch zur drei Stunden Messung (p ≤ 0,001) und zur sechs Stunden Messung (p ≤ 0,01) nachgewiesen (Tabelle 9).

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Tabelle 9: Gesamtmotilität der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe ohne elektr. Feld in %

In der Tabelle 10 wird deutlich, dass zwischen den drei Behandlungsgruppen zu keinem Messzeitpunkt der Vorwärtsbeweglichkeit ein signifikanter Unterschied bestand. Die Messung der unbehandelten Kontrolle zur Stunde null (56,8 ± 13,8%) und nach sechs Stunden (29,8 ± 15,5) unterschieden sich signifikant (p ≤ 0,01). Bei der sortierten Kontrollgruppe waren sowohl die null Stunden Messung (54,3 ± 12,9%) und die sechs Stunden Messung (21,9 ± 19,9%) signifikant verschieden (p ≤ 0,001), als auch die drei Stunden Messung (45,9 ± 20,9%) und der sechs Stunden Wert (21,9 ± 19,9%) (p ≤ 0,05).

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Tabelle 10: Vorwärtsbeweglichkeit der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe ohne elektr. Feld in %

Bei der Ermittlung der BCF der Spermienköpfe konnte gezeigt werden, dass ein signifikanter zeitlicher Einfluss bestand (Tabelle 11). Die unsortierten Spermien hatten eine Frequenz von 37,9 ± 2,4Hz zur Stunde null; dies war signifikant höher als die Frequenz nach sechs Stunden Lagerung (31,8 ± 1,9Hz) (p ≤ 0,01). Die nach Standardprotokoll sortierten Spermien zeigten signifikante Abweichungen zwischen der null Stunden Messung (28,8 ± 3,2Hz) und der drei Stunden Messung (22,3 ± 4,9Hz) mit p ≤ 0,001 und auch zur sechs Stunden Messung (21,7 ± 2,9Hz) (p ≤ 0,001). Bei der Versuchsgruppe der Spermien, die den Sorter mit ausgeschaltetem elektrischem Feld passierten, konnte ein signifikanter Abfall nur zwischen dem null Stunden Wert (29,5 ± 2,4Hz) und dem sechs Stunden Messwert (22,1 ± 2,9Hz) gezeigt werden (p ≤ 0,001). Betrachtet man die Ergebnisse zu den jeweiligen Messzeitpunkten, so besitzen zur null Stunden Messung die unsortierten Spermien (37,9 ± 2,4Hz) eine signifikant höhere Frequenz der BCF als die normal sortierten Spermien (28,8 ± 3,2Hz) (p ≤ 0,001). Im weiteren Versuchsverlauf zeigten sich statistisch relevante Unterschiede zur drei Stunden Messung zwischen der unsortierten Versuchsgruppe (33,9 ± 3,1Hz) zu beiden sortierten

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Behandlungsgruppen (22,3 ± 4,9Hz und 25,9 ± 3,5Hz) (jeweils p ≤ 0,001). Diese signifikanten Abweichungen galten ebenfalls für die sechs Stunden Messung.

Tabelle 11: BCF der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe ohne elektr. Feld in Hz

Betrachtet man den mittleren seitlichen Kopfausschlag der Spermien in den drei Versuchsgruppen, so konnte über die Zeitachse keine signifikante Veränderung innerhalb der drei Behandlungen ermittelt werden (Tabelle 12). Jedoch konnte ein Einfluss des Sortierens auf die ALH ermittelt werden, unabhängig davon, ob das elektrische Feld ein- oder ausgeschaltet war. Wie Tabelle 12 zeigt, ist zu allen drei Untersuchungszeitpunkten die mittlere seitliche Kopfauslenkung der unsortierten Versuchsgruppe signifikant höher als die der beiden Behandlungsgruppen (p ≤ 0,001). Zwischen den standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe mit deaktiviertem elektrischem Feld konnte keinerlei signifikanter Unterschied festgestellt werden.

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Tabelle 12: ALH der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe ohne elektr. Feld in µm

Wurde der Anteil an Spermien mit einem hohen MMP mittels Flowzytometrie ermittelt, so konnte man innerhalb der Behandlungsgruppen über die drei Messzeitpunkte null Stunden, drei Stunden und sechs Stunden keine statistisch signifikante Abweichung feststellen. Wohingegen zwischen den Behandlungsgruppen zu identischen Messzeitpunkten große Unterschiede lagen.

Der Anteil Spermien mit einem hohen MMP in der unbehandelten Kontrollgruppe zur null Stunden Messung lag bei 20,9 ± 5,8%. Dieser Anteil war signifikant höher als die ermittelten Werte der normal sortierten Spermien (5,9 ± 2,9%) und der Versuchsgruppe ohne elektrisches Feld (7,0 ± 4,3%) jeweils zur null Stunden Messung. Wie in Tabelle 13 zu sehen, wurde dieser signifikante Einfluss des Sortierens auf den Anteil an Spermien mit einem hohen MMP in der drei und sechs Stunden Messung bestätigt. In allen nachgewiesenen statistisch signifikanten Abweichungen lag die Irrtumswahrscheinlichkeit bei p ≤ 0,001.

63

Tabelle 13: Anteil Spermien mit einem hohen MMP der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe ohne elektr. Feld in

%

Bei der Untersuchung der drei Versuchsgruppen auf ihren ATP-Gehalt mittels Lumineszenzmessung wurde kein signifikanter Abfall des ATP-Gehaltes über den Zeitverlauf ermittelt (Tabelle 14). Es konnte aber gezeigt werden, dass zur null Stunden Messung die unsortierte Kontrollgruppe (1,8 ± 0,6nM ATP) einen signifikant höheren ATP-Gehalt als die Versuchsgruppe der sortierten Spermien mit deaktiviertem elektrischem Feld (0,8 ± 0,3nM ATP) hatte (p ≤ 0,001). Zur Behandlungsgruppe der standardsortierten Spermien bestand keine signifikante Abweichung. Gleiches galt für die Ergebnisse der drei Stunden Messung (p ≤ 0,01).

Bei der sechs Stunden Messung hingegen konnte ein signifikanter Unterschied zwischen der unsortierten Behandlungsgruppe (1,5 ± 0,5nM ATP) und der sortierten Spermien ohne elektrisches Feld (0,7 ± 0,2nM ATP) nachgewiesen werden (p ≤ 0,01). Zusätzlich bestand ein signifikant geringerer Gehalt an ATP in der Versuchsgruppe ohne elektrisches Feld (0,7 ± 0,2nM ATP) zur Versuchsgruppe der normal sortierten Spermien (1,5 ± 0,5nM ATP) (p ≤ 0,01).

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Tabelle 14: ATP-Gehalt der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe ohne elektr. Feld in nM

4.6 Versuch 6: Reduzierung der Schwingungsamplitude des Piezokristalls durch Senkung der Amplitudenspannung auf minimal 3 Volt im Vergleich zu den Standardsortierbedingungen (30 Volt) und unbehandelten Spermien

Wurde die Motilität der drei Versuchsgruppen zur Stunde null miteinander statistisch verglichen (Tabelle 15), so zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen der unbehandelten Versuchsgruppe (68,2 ± 13,0%) und der standardsortierten Gruppe (85,5 ± 9,1%) (p ≤ 0,01) und auch zur Versuchsgruppe mit reduzierter Spannung im Ablenkungsfeld (85,8 ± 6,3%) (p ≤ 0,01.) Diese statistisch signifikanten Unterschiede der beiden sortierten Gruppen jeweils zur unsortierten Gruppe konnten mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,001 ebenfalls zur drei Stunden und zur sechs Stunden Messung gezeigt werden (Tabelle 15). Innerhalb der Behandlungsgruppen zeigten sich über den Zeitverlauf ebenfalls signifikante Abweichungen. So war die Motilität der unsortierten Gruppe zur Stunde null (68,2 ± 13,0%) signifikant höher (p ≤

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0,001) als zur sechs Stunden Motilität (38,3 ± 16,8%). Zwischen der drei Stunden Messung (54,6 ± 5,8%) und der sechs Stunden Messung (38,3 ± 16,8%) des unbehandelten Spermas gab es ebenfalls einen signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05).

Bei den sortierten Gruppen konnten signifikante Unterschiede nur zwischen den null Stunden Werten und den sechs Stunden Messungen nachgewiesen werden. Bei der normal sortierten Versuchsgruppe war p ≤ 0,01, bei der gesexten Gruppe mit minimaler Spannung p ≤ 0,05.

Tabelle 15: Gesamtmotilität der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe mit reduzierter Amplitudenspannung in %

Die Untersuchung der vorwärts gerichteten Motilität konnte zeigen, dass nur in der unsortierten Gruppe ein signifikanter Zeiteinfluss nachgewiesen werden konnte (Tabelle 16). Die null Stunden Messung (65,9 ± 13,3%) war signifikant höher als die sechs Stunden Messung (32,9 ± 17,2%) (p ≤ 0,001). Zusätzlich war auch die drei Stunden Messung (51,3 ± 6,7%) signifikant höher als die sechs Stunden Messung (32,9 ± 17,2%) (p ≤ 0,05). Tabelle 16 zeigt, dass nur zur Stunde sechs ein signifikanter Unterschied zwischen den Versuchsgruppen nachgewiesen werden

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konnte, wobei die unbehandelten Spermien (32,9 ± 17,2%) signifikant weniger vorwärtsbeweglich waren als die normal sortierten Spermien (53,8 ± 17,9%) (p ≤ 0,01) und auch als die sortierten Spermien mit reduzierter Spannung (58,5 ± 19,9%) (p ≤ 0,001).

Tabelle 16: Vorwärtsbeweglichkeit der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe mit reduzierter Amplitudenspannung in %

In Tabelle 17 sind die Werte der BCF für die drei Versuchsgruppen zu unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten dargestellt. Der Zeiteinfluss konnte signifikant in der unbehandelten Versuchsgruppe zwischen der null Stunden Messung (36,1 ± 1,9Hz) und des sechs Stunden Wertes (32,8 ± 1,7Hz) mit p ≤ 0,05 gezeigt werden. Die Messung der normal sortierten Behandlungsgruppe ergab, dass auch dort ein signifikanter Einfluss durch die Zeit stattfindet, die null Stunden Messung (29,2 ± 2,3Hz) und die sechs Stunden BCF (24,0 ± 3,0Hz) waren signifikant unterschiedlich (p ≤ 0,001), auch die drei Stunden Werte (27,5 ± 2,8Hz) und die sechs Stunden Messung (24,0 ± 3,0Hz) waren signifikant verschieden (p ≤ 0,01).

Innerhalb der drei Untersuchungszeitpunkte war mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit

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von p ≤ 0,001 die unsortierte Gruppe signifikant höher als die der standardsortierten Gruppe und auch als die der Versuchsgruppe mit minimierter Amplitudenspannung (Tabelle 17).

Tabelle 17: BCF der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe mit reduzierter Amplitudenspannung in Hz

Die Untersuchung zur seitlichen Auslenkung der Spermienköpfe (Tabelle 18) ergab, dass ein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,001) zwischen der null Stunden Messung der unbehandelten Versuchsgruppe (2,7 ± 0,4µm) und der drei Stunden Messung (2,2 ± 0,3µm) und der sechs Stunden Messung (2,1 ± 0,2µm) (p ≤ 0,001) bestand.

Tabelle 18 stellt außerdem dar, dass zu jedem Messzeitpunkt ein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,001) zwischen der unbehandelten Versuchsgruppe zu beiden Behandlungsgruppen bestand.

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Tabelle 18: ALH der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe mit reduzierter Amplitudenspannung in µm

Bei der Messung des Anteils der Spermien mit hohem MMP konnte nur zum Zeitpunkt der drei Stunden Messung ein signifikanter Unterschied zwischen zwei Versuchsgruppen nachgewiesen werden (Tabelle 19). Es zeigte sich, dass die unbehandelte Gruppe mit 12,7 ± 4,8% Spermien mit einem hohen MMP einen signifikant höheren Anteil besaß, als die Gruppe der standardsortierten Spermien mit 6,1 ± 2,7% und einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05.

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Tabelle 19: Anteil Spermien mit hohem MMP der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe mit reduzierter Amplitudenspannung in %

Die Untersuchung des ATP-Gehaltes (Tabelle20) zeigte, dass in der unsortierten Gruppe ein signifikanter Abfall zwischen der null Stunden Gruppe (3,4 ± 1,1nM ATP) und der sechs Stunden Messung (2,3 ± 0,8nM ATP) nachzuweisen war (p ≤ 0,01).

Die Messung der Behandlungsgruppen zur Stunde null ergab, dass ein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,001) zwischen der unbehandelten Gruppe (3,4 ± 1,0nM ATP) und der normal sortierten Gruppe (1,4 ± 0,3nM ATP) und auch zur sortierten Gruppe mit reduzierter Amplitudenspannung (1,3 ± 0,28nM ATP) (p ≤ 0,001) bestand. Auch zur drei Stunden Messung konnte ein signifikanter Unterschied zwischen der unsortierten Versuchsgruppe und den anderen Behandlungsgruppen nachgewiesen werden. Die unsortierte Versuchsgruppe hatte einen signifikant höheren Gehalt an ATP (2,6 ± 1,0nM ATP) als die normal sortierte Gruppe(1,4 ± 0,3nM ATP) (p ≤ 0,01) und auch als die mit reduzierter Spannung sortierten Spermien (1,1 ± 0,2nM ATP) (p

≤ 0,001). In der sechs Stunden Messung konnte nur zwischen der unsortierten Gruppe (2,3 ± 0,8nM ATP) ein signifikant höherer Gehalt an ATP (p ≤ 0,01) gegenüber der sortierten Behandlungsgruppe mit minimierter Amplitudenspannung (1,2 ± 0,2nM ATP) nachgewiesen werden.

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Tabelle 20: ATP-Gehalt der unsortierten Spermien, der standardsortierten Spermien und der Versuchsgruppe mit reduzierter Amplitudenspannung in nM

4.7 Versuch 7: Einfluss der Deaktivierung des Lasers während der geschlechtsspezifischen Sortierung auf die Spermienintegrität

Die Untersuchung der Gesamtmotilität ergab, dass es nur in der Versuchsgruppe mit deaktiviertem Laser einen zeitlich signifikanten Einfluss gab (Tabelle 21). So war der Abfall der Motilität von der null Stunden Gruppe (70,0 ± 7,2%) gegenüber der sechs Stunden Gruppe (50,8 ± 14,5%) signifikant (p ≤ 0,05). Betrachtet man die einzelnen Behandlungsgruppen zu den jeweiligen Messzeitpunkten, so konnte zur Stunde null ein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen der unbehandelten Gruppe (69,3 ± 9,9%) und der normal sortierten Gruppe (89,5 ± 2,7%) festgestellt werden. Zusätzlich gab es signifikante Abweichungen (p ≤ 0,05) zwischen der normal sortierten Gruppe

Die Untersuchung der Gesamtmotilität ergab, dass es nur in der Versuchsgruppe mit deaktiviertem Laser einen zeitlich signifikanten Einfluss gab (Tabelle 21). So war der Abfall der Motilität von der null Stunden Gruppe (70,0 ± 7,2%) gegenüber der sechs Stunden Gruppe (50,8 ± 14,5%) signifikant (p ≤ 0,05). Betrachtet man die einzelnen Behandlungsgruppen zu den jeweiligen Messzeitpunkten, so konnte zur Stunde null ein signifikanter Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen der unbehandelten Gruppe (69,3 ± 9,9%) und der normal sortierten Gruppe (89,5 ± 2,7%) festgestellt werden. Zusätzlich gab es signifikante Abweichungen (p ≤ 0,05) zwischen der normal sortierten Gruppe

Im Dokument Luminometrische Verlaufskontrolle des ATP-Gehaltes von flowzytometrisch geschlechtsdifferenzierten bovinen Spermien (Seite 59-0)