Bestimmung des ATP-Gehaltes

Der ATP-Gehalt der Spermien wurde mittels Biolumineszenz mit dem Sirius Single Tube Luminometer (Berthold Detection Systems, Pforzheim, Deutschland) ermittelt.

Das Messprinzip beruht auf einer Biolumineszenzmessung, d.h. auf der Emission von Licht, das bei der Reaktion von ATP mit D-Luciferin unter Katalyse des Enzyms Luciferase des Glühwürmchens (Photinus pyralis) entsteht (K^ISSEL, 2009).

Für die Messung wurden 5 ml Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) verwendet. Um die maximale Lumineszenz nach der Zugabe des ATP-Reagenz zu ermitteln, war eine gewisse Reaktionszeit bis zur homogenen Verteilung der Reagenzien zu gewährleisten. Entsprechend wurde eine Verzögerungszeit vor der eigentlichen Messung auf zwei Sekunden eingestellt. Anschließend wurde das emittierte Lichtsignal über fünf Sekunden gemessen. Das Lichtsignal wurde als

„Relative Light Unit per second“ (RLU/s) erfasst. Dazu ermittelt das Messgerät den Mittelwert der Lichtemission über den Messzeitraum. Bei jeder Messung wurde zunächst der Leerwert des ATP-Reagenzes ermittelt. Er gibt für jede Messung an, ob der Reaktionsansatz vor Zugabe der extrahierten Spermienlösung bereits eine Lumineszenz z. B. durch Kontaminationen, aufweist. Anschließend wurden die RLU/s der Probe durch Zugabe der extrahierten Spermienlösung ermittelt. Der Leerwert wurde anschließend von dem Ergebnis subtrahiert, um Messimpulse, die nicht auf den ATP-Gehalt der Probe zurückzuführen sind, von der Auswertung auszuschließen.

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Zur Vorbereitung der Messprobe wurde ein Aliquot des Ejakulats mittels Sexcess-Sample® wie oben beschrieben auf 10x10⁶ Spermien pro ml verdünnt. Die ATP-Extraktion erfolgte durch die Zugabe von 100µl Trichloressigsäure (TCA) (10%ig in entionisiertem Wasser, Carl Roth, Karlsruhe Deutschland) zu 100µl der 10x10⁶ Spermien/ml Lösung und anschließender Inkubation auf Eis für 30 Minuten. Hierauf folgend wurde die Probe mit 200µl TRIS-EDTA-Puffer (ATP-Kit SL, BioThema AB, Handen, Schweden) versetzt. Danach wurden 25µl dieser Lösung zu 800µl Gesamtvolumen mit TRIS-EDTA-Puffer aufgefüllt. Aus dieser Probe wurde schließlich der ATP-Gehalt ermittelt. Als erste Messung wurde der Leerwert des verwendeten 5ml Röhrchens (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) durch pipettieren von 40µl ATP-Reagenz in das saubere Röhrchen ermittelt. Das ATP-Reagenz enthielt D-Luciferin, Luciferase, lysierende Agenzien und ATPase-Inhibitoren. Für die zweite Messung wurden 160µl der Probenlösung hinzugegeben und ebenfalls die Lumineszenz ermittelt. Im Anschluss wurde diesem Probenansatz 10µl des internen ATP-Standards mit einer Konzentration von 2µM ATP/ml zugesetzt und gemessen.

Aus diesen drei Messungen wurde nun der ATP-Gehalt der Probe nach folgender Formel berechnet:

ATP Sperma = ATP Standard x RLU/s Sperma_____

RLU/s Sperma+Standard – RLU/s Sperma

In dieser Arbeit wird der ATP-Gehalt immer für 10x10⁶ Spermien pro ml in nM ATP angegeben.

37 3.1.3 Motilitätsanalyse

Um die Motilität des verwendeten Frischsamens objektiv beurteilen zu können, wurden Untersuchungen mit dem IVOS Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA) Version 12.0 der Firma Hamilton Thorne Bioscience (Beverly, MA, USA) durchgeführt. Das Gerät war mit einer Makler®-Zählkammer (Sefi-Medical Instruments Ltd., Haifa, Israel) ausgestattet, welche durch eine Wärmeplatte konstant auf 37°C gehalten wird. Für die Messung wurden die Spermien mit dem Verdünner Sexcess-Sample® auf 10x10⁶ Spermien pro ml wie oben beschrieben verdünnt. Alle Proben wurden vor der Messung mindestens 10 min auf einem Wärmeblock bei 37°C inkubiert. 10µl dieser Probe wurden in die Makler®-Kammer pipettiert.

Anschließend wurden von zehn zufällig ausgesuchten Feldern der Makler®-Kammer je 60 Aufnahmen gemacht und die Motilitätsparameter durch die Software des CASA Gerätes erhoben.

Da das CASA Gerät mit einer Halogen-Lichtquelle ausgestattet ist, war es möglich, die Motilitätsbestimmung auch mit Spermien durchzuführen, welche nach dem Sortierprozess in ein eidotterhaltiges Medium überführt wurden. Durch den Farbstoff Hoechst 33342 (BisBenzimide H33342, Trihydrochloride, Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) konnte eine sichere Differenzierung gegenüber Verdünnerkomponenten wie z.B. Eidotterpartikeln möglich gemacht werden. Für den Sortiervorgang wurden die Spermien bereits mit dem Fluoreszenzfarbstoff H33342 angefärbt, der spezifisch an die DNA bindet und auch nach dem Sortieren in den Spermienköpfen verbleibt. Proben, die den Sortierprozess nicht durchliefen und daher zunächst ungefärbt waren, welche aber eidotterhaltige Medien enthielten, wurden vor der Motilitätsmessung ebenfalls mit 5µl der Hoechst 33342-Stammlösung (5mg Hoechst 33342 in 1ml Aqua bidest gelöst, Konzentration: 8,9mM/ml) angefärbt.

Anschließend erfolgte eine Inkubation der Probe über 15min bei 37°C auf dem Wärmeblock.

Zur Motilitätsanalyse wurde jeweils eine Doppelbestimmung durchgeführt und der prozentuale Anteil beweglicher Spermien (Motilität), der prozentuale Anteil

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vorwärtsbeweglicher Spermien, die mittlere seitliche Kopfauslenkung der Spermien in µm (ALH) und die Frequenz der Pendelbewegung der Spermienköpfe in Hz (BCF) ausgewertet. Die gewählten Geräteeinstellungen für die CASA-Messungen sind im Anhang aufgeführt.

3.1.4 Mitochondrienaktivität

Zur Bestimmung der Mitochondrienaktivität wurde das Sperma nach spezifischer Anfärbung flowzytometrisch untersucht. Dem Messprinzip der Durchflusszytometrie (FACS) liegt zugrunde, dass die zu untersuchenden Zellen durch eine Hohlnadel mittels Druckluft in die Messküvette des Messgerätes gedrückt werden. Im Messgerät werden sie in einer Flüssigkeit (FACSFlow Sheath Fluid®) transportiert.

Die Proben werden durch einen Dioden-Laser bei einer Wellenlänge von 638nm bzw. einem Argon-Ionen-Laser mit einer Wellenlänge von 488nm angeregt. Durch unterschiedliche Eigenschaften der Zellen in Granularität und Größe wird der Strahl des emittierten Lichts unterschiedlich stark gebrochen. Die Ablenkung des einfallenden Lichts in Richtung des einfallenden Lichtstrahls bezeichnet man als Vorwärtsstreulicht (FSC = forward scatter), die Ablenkung des Lichts, das rechtwinklig zum Strahlengang gestreut wird, ist das Seitwärtsstreulicht (SSC = side scatter). Die Zellen können mit fluoreszierenden Farbstoffen (Fluorochromen) versetzt werden, die je nach Absorptionsspektrum Licht in einer für sie typischen Wellenlänge emittieren (KISSEL, 2009). Es wurde das Flowzytometer GALLIOS 2/6 (Beckman Coulter Inc., Brea, USA) verwendet. Das Gerät besitzt zwei Laser, (488nm, 22mW und 638nm, 25mW). Zur Fluoreszenzmessung stehen sechs Filter zur Verfügung. Für die Bestimmung des Mitochondrienmembranpotentials wurde der Feststofflaser mit 488nm verwendet. Der Filter FL-1 (530/30 nm) wurde zur Detektion der Grünfluoreszenz verwendet, für die Orangefluoreszenz wurde der Filter FL-2 (585/42 nm) eingesetzt. Zur Bestimmung der Rotfluoreszenz wurde Filter FL-6 (650LP nm) aktiviert. Die weiteren Geräteeinstellungen des Flowzytometers sind im Anhang aufgeführt. Bei jeder Messung wurden 10.000 Zellen als Doppelmessung

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erfasst. Für die Bestimmung des Mitochondrienmembranpotentials wurden die Spermien mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5,5‘,6,6’tetrachloro-1,1‘,3,3‘-tetraethylbenzimidazolcarbocyanin-jodid (JC-1, Invitrogen™, Karlsruhe, Deutschland) angefärbt. JC-1 ist ein membranpermeables Cyanid mit einer delokalisierten positiven Ladung. Es dringt in monomerer Form in die negativ geladene Mitochondrienintermembranmatrix ein. Durch ein hohes negatives Mitochondrienmembranpotential (MMP) akkumuliert JC-1 vor allem im Intermembranraum. Ab einer Membranspannung von -80 bis -100mV bilden sich JC-1 Aggregate. Die Aggregatbildung führt dazu, dass der Farbstoff bei einer Wellenlänge von 590nm orange fluoresziert, während im Gegensatz die monomere Form, welche bei einem niedrigen MMP vorliegt, bei einer Wellenlänge von 527nm grünes Licht emittiert. Bei den Spermien mit einem hohen MMP fluoreszieren die Mittelstücke orange und können so von der Population mit einem niedrigeren MMP (Grünfluoreszenz) unterschieden werden.

Für die Messung wurden zwei Proben auf ein Endvolumen von je 500µl mit TRIS-Sample Verdünner (199,98mM Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan, 64,72mM Zitronensäure-Monoydrat, 95,5mM D-Fruktose und 50mg/l Gentamicin-Sulfat verdünnt in zweifach destilliertem Wasser) auf eine Endkonzentration von 1x10⁶ Spermien pro ml eingestellt. Anschließend wurden die Proben mit 10µl JC-1 (0,125mM in DMSO) versetzt und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Falls in der Probenlösung ein eidotterhaltiger Verdünner genutzt wurde, wurden 3µl SYTO® 17 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain - 5mM Solution in DMSO (Invitrogen™, Karlsruhe, Deutschland), den oben beschriebenen Messansätzen hinzu gegeben, um eine eindeutige Unterscheidung von Spermien zu Eidotterpartikeln gewährleisten zu können. Bei der Auswertung der erfassten Daten wurden nicht gefärbte Partikel, wie z.B. die aus dem Verdünner stammenden Eidotterpartikel, aus der Berechnung ausgeschlossen.

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3.1.5 Morphologische Veränderungen an Spermien

Zur Beurteilung morphologischer Veränderungen an den Spermien wurden 100µl mit einer Konzentration von 10x10⁶ Spermien pro ml von jedem Ejakulat mit 200µl Hancock-Lösung (Hancock-Fixator: 2,784 g Tri-Natriumzitrat-Dihydrat, 4 ml 37%ige Formaldehyd-Lösung in zweifach destilliertem Wasser auf 100 ml) fixiert. Für die visuelle Untersuchung wurden 7µl der Probe auf einen Objektträger gegeben. Mittels Phasenkontrastmikroskop (Olympus BX 60, Hamburg, Deutschland) und 1000-facher Vergrößerung wurden 200 Spermien ausgewertet. Die morphologischen Abweichungen wurden in einem modifiziertem Protokoll (KRAUSE, 1966) dokumentiert, wobei zwischen primären, sekundären und tertiären morphologischen Abweichungen unterschieden wurde (s. Kapitel 9.4). Es wurden in dieser Arbeit nur Ejakulate verwendet, die weniger als 30% morphologisch veränderte Spermien aufwiesen.

3.1.6 Geschlechtsspezifische Differenzierung der Spermien

Um die Spermien geschlechtsspezifisch zu differenzieren, wurden Teile des jeweiligen Ejakulats mit dem Sexcess-Sample® Verdünner auf eine Konzentration von 100x10⁶ Spermien pro ml verdünnt. Das Gesamtvolumen eines Ansatzes betrug 1ml und wurde in 1,5ml Eppendorf-Gefäßen bei 37°C gelagert. Die eine Hälfte der Proben wurde mit 20µl, die andere Hälfte mit 25µl einer 8,9mM Hoechst 33342-Lösung (BisBenzimide H33342, Trihydrochloride, Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) versetzt. Durch diese Aufbereitung wurde im weiteren Versuchsverlauf die Hoechst 33342 Fluoreszenzfarbstoff-Konzentration für jeden Versuchstag neu bestimmt, die sich für das spezifische Ejakulat bei der durchflusszytometrischen Geschlechtsdifferenzierung am besten eignete. Die Proben wurden eine Stunde unter Lichtausschluss bei 37°C auf einem Wärmeblock inkubiert.

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Im Anschluss an die Inkubationszeit wurden die Proben bei Raumtemperatur dunkel gelagert und innerhalb von sechs Stunden nach der Ejakulatgewinnung sortiert.

Die geschlechtsspezifische Differenzierung erfolgte in Anlehnung an die Beltsville Sperm Sexing Technologie (JOHNSON et al., 1999). Vor dem Sortieren wurden die vorbereiteten Spermaproben durch ein 51µm Zellenmikrosieb (Falcon Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA) gegeben und in ein Flow-Röhrchen überführt. Anschließend wurde 1µl Lebensmittelfarbstoff FD&C#40 (Warner Jekinson Company Inc., St. Louis, USA; Lebensmittelfarbstoff: 25 mg Food dye FD&C#40 in 1 ml zweifach destilliertem Wasser) zu den Spermien pipettiert. Dieser Farbstoff penetriert ausschließlich membrandefekte Spermien und bindet ebenso wie Hoechst 33342 an die Spermien-DNA, wobei er diesen Farbstoff überlagert. Spermien mit einer Membranschädigung werden somit während der durchflusszytometrischen geschlechtsspezifischen Differenzierung erkannt und vom Sortierprozess ausgeschlossen. Die Sortierung wurde mit einem modifizierten High-Speed-Flowzytometer MoFlo® SX (Beckman Coulter, Miami, USA) durchgeführt, das mit einem Yttrium Vanadat Feststofflaser (Coherent Laser® Dieburg, Deutschland) ausgestattet ist. Er arbeitet bei einer Wellenlänge von 351nm und wurde auf eine Leistung von 180mW justiert. Als Medium für den Hüllstrom wurde eine TRIS-basierte Salzlösung verwendet. 7,0x10⁶ Spermien jeden Geschlechts wurden in konische 10ml Plastikröhrchen sortiert (Greiner, Nürtingen, Deutschland), die zuvor mit 500µl TEST-TRIS-Eigelb-Puffer (188,73mM N-Tris-Hydromethyl-Methyl-2-Aminomethan (TEST), 84,87mM Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan, 11,1mM Glukose, 0,05g/l Gentamicin-Sulfat und 25g/l Eigelb in zweifach destillierten Wasser, pH 7,4) pro Röhrchen als Auffangmedium befüllt wurden (JOHNSEN et al., 1999).

Unmittelbar nach dem Sortiervorgang wurden die geschlechtsspezifisch differenzierten Spermien 20min bei 900U/min und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und verworfen. Das Spermienpellet wurde mit Sexcess® (Masterrind, Verden, Deutschland), einem eidotterhaltigen Verdünner mit Zusatz von Antioxidantien, resuspendiert und auf eine Konzentration von 10x10⁶ Spermien pro ml eingestellt. Die Proben wurden anschließend bei 37°C auf dem Wärmeblock gelagert.

42 3.2 Versuche

3.2.1 Versuch 1: Etablierung weiterer Verdünnungsstufen für die Lumineszenzmessung

Im ersten Versuchsabschnitt wurde untersucht, ob die eingesetzte Spermienkonzentration für die zuverlässige Lumineszenzmessung reduziert werden kann. M. MÖNCH-TEGEDER (2011) nutze eine Verdünnungsstufe von 20x10⁶ Spermien/ml in Sexcess-Sample® als Standardkonzentration. Die Spermiendichte wurde nun auf 10x10⁶ Spermien/ml und 5x10⁶ Spermien/ml reduziert. Diese drei Verdünnungsstufen wurden ausgehend von einer 100x10⁶ Spermien/ml Konzentration unter Zugabe von Sexcess-Sample® und einem Endvolumen von 1ml hergestellt. Während der Versuchszeit wurden sie bei 37°C auf dem Wärmeblock gelagert. Die drei Verdünnungsstufen wurden nun mittels ATP-Gehaltsbestimmung, CASA-Motilitätsmessung, JC-1-MMP Bestimmung und Ermittlung der morphologischen abweichenden Spermienformen untersucht. Die einzelnen Verfahrensschritte wurden wie unter 3.1.1 bis 3.1.5 beschrieben angewendet.

3.2.2 Versuch 2: Untersuchung des Einfluss des Sexcess®-Verdünners auf die Lumineszenzmessung

Im zweiten Versuchsteil wurde ermittelt, ob die ATP-Gehaltsbestimmung mittels Lumineszenz durch den eidotterhaltigen Verdünner Sexcess® (Masterrind, Verden) beeinträchtigt wird. Hierzu wurden aus demselben Frischejakulat eines Bullen zwei Verdünnungen mit jeweils 100x10⁶ Spermien/ml hergestellt; eine Verdünnung wurde mit Sexcess-Sample® angesetzt, die andere wurde unter Zugabe von Sexcess®

verdünnt. Das Endvolumen betrug jeweils 1ml. Hiervon ausgehend wurden 10x10⁶Spermien/ml Verdünnung jeweils mit Sexcess-Sample® bzw. mit Sexcess®

für die Untersuchungen hergestellt und bei 37°C auf dem Wärmeblock gelagert.

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Diese wurden dann auf ihren ATP-Gehalt untersucht, eine Motilitätsanalyse durchgeführt, die Mitochondrienaktivität mittels JC-1 erhoben und die morphologischen Abweichungen bestimmt.

3.2.3 Versuch 3: Einfluss des Hoechst 33342-Farbstoff auf die Bestimmung des ATP-Gehalt

Zur Ermittlung der möglichen Einflüsse einer Färbung der Spermien mittels Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) auf die Höhe des ATP-Gehaltes wurden 2 Verdünnungen von demselben Ejakulat mit 10x10⁶Spermien/ml in Sexcess-Sample® hergestellt. Einer Verdünnung wurden 20µl Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) zugesetzt, die andere diente als Kontrollgruppe und blieb ungefärbt. Beide wurden bei 37°C auf dem Wärmeblock für eine Stunde unter Lichtabschluss inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Ermittlung des ATP-Gehaltes, die Motilitätsanalyse, die Bestimmung der Mitochondrienaktivität mittels JC-1 und die Auswertung der morphologischen Abweichungen.

3.2.4 Versuch 4: Einfluss der flowzytometrischen Sortierung von Spermien auf das MMP, den ATP-Gehalt und weitere Motilitätsparameter

In diesem Versuch wurde der Gesamteinfluss, den der Sortiervorgang auf die oben beschriebenen Spermienparameter hat, ermittelt. Hierzu wurde das frisch gewonnene Bullenejakulate mittels Sexcess-Sample® auf eine Verdünnung von 100x10⁶ Spermien/ml und einem Endvolumen von 1ml verdünnt. Hiervon wurden 15 Aliquots angefertigt. Zehn Teile wurden nach der Zugabe von 20µl Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) einer einstündigen Inkubation bei 37°C unterzogen. Diese wurden im Anschluss nach dem Standardprotokoll flowzytometrisch sortiert. Die verbliebenen Aliquots wurden mit Sexcess-Sample®

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auf eine Endkonzentration von 10x10⁶ Spermien/ml und einem Endvolumen von 1ml gebracht und dienten als Kontrollgruppe, die bei 37°C gelagert wurde. Nach einer Anpassungszeit von 20min wurde von dieser Kontrollgruppe der Null-Stunden-Wert für alle oben beschriebenen Parameter ermittelt. Weitere Messungen wurden nach drei und sechs Stunden durchgeführt.

Die mit Hoechst 33342 behandelte Gruppe wurde nach der Inkubation und dem Sortiervorgang unter der Zugabe von Sexcess®-Verdünner ebenfalls auf 10x10⁶ Spermien/ml verdünnt und bei 37°C gelagert. Es wurden die Gesamtmotilität, Vorwärtsbeweglichkeit, BCF, ALH, der Anteil Spermien mit einem hohen MMP und der ATP Gehalt nach null, drei und sechs Stunden ermittelt.

3.2.5 Versuch 5: Geschlechtsspezifische Differenzierung der Spermien unter Standardbedingungen und nach Deaktivierung des elektrostatischen Ablenkungsfeldes

Das frisch gewonnene Bullenejakulat wurde den Eingangsuntersuchungen unterzogen und im Anschluss auf 100x10⁶ Spermien/ml mit Sexcess-Sample® auf ein Endvolumen von 1ml verdünnt und bei 37°C gelagert. Es wurden 15 Probenansätze dieser Verdünnung hergestellt. Zehn dieser Proben wurde 20µl Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) zugesetzt und eine Stunde bei 37°C unter Lichtabschluss gelagert. Die restlichen fünf Proben blieben ungefärbt. Sie wurden mittels Sexcess-Sample® auf 10x10⁶ Spermien/ml weiter verdünnt, ebenfalls bei 37°C gelagert und dienten als unbehandelte Kontrollgruppe für den gesamten Versuchstag. Nach einer Inkubationszeit von 20min auf dem Wärmeblock wurde die unbehandelte Kontrollgruppe zum ersten Mal gemessen (0h Wert); es wurden ATP-Gehalt, MMP, Motilität und morphologischen Abweichungen ermittelt. Die weitere Lagerung der Probe erfolgte bei 37°C. Eine erneute Messung der Parameter fand nach drei und sechs Stunden statt.

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Die mit Hoechst 33342 angefärbten Proben wurden nach einer Stunde Inkubationszeit für den Sortiervorgang aufbereitet. Das weitere Vorgehen erfolgte wie unter 3.1.6 erläutert.

Für die Versuchsgruppe wurde während der Ablenkung der Spermien zur geschlechtsspezifischen Trennung das elektrische Feld ausgeschaltet. Da die geschlechtsspezifische Differenzierung für diesen Versuchsablauf nicht entscheidend war, wurden die Spermien nach erfolgreicher Passage des Sorters in einem 50ml Röhrchen (Greiner, Nürtingen, Deutschland) aufgefangen, welches zuvor mit 500µl TEST-TRIS-Eigelb-Puffer pro Röhrchen als Auffangmedium befüllt wurde (JOHNSON

et al., 1999). Die im direkten Anschluss sortierte Kontrollgruppe wurde nach dem Standardprotokoll sortiert.

Nach dem Sortiervorgang wurden die Proben mittels Sexcess® ebenfalls auf 10x10⁶Spermien/ml verdünnt. Die weitere Lagerung erfolgte bei 37°C unter Lichtabschluss. Direkt nach dem Sortiervorgang wurde der 0h-Wert (ATP-Gehalt, Motilität, MMP, Morphologie) für beide sortierten Gruppen ermittelt, sowohl für die Versuchsgruppe mit ausgeschaltetem elektrischem Feld als auch für die Kontrollgruppe, welche nach dem Standardverfahren sortiert wurde.

Die drei Gruppen wurden auf dem Wärmeblock bei 37°C gelagert. Nach 3h und 6h wurden erneut alle Versuchsgruppen auf ATP-Gehalt, Motilität und MMP untersucht.

3.2.6 Versuch 6: Minimierung der Schwingungsamplitude des Piezokristalls durch Spannungsabsenkung während der geschlechtsspezifischen Differenzierung

Für diese Versuchsgruppe wurde ebenfalls ein Frischejakulat eines Bullen mittels Sexcess-Sample® auf 100x10⁶Spermien/ml in 15 Aliquots mit einem jeweiligen Endvolumen von 1ml abgefüllt. Zehn dieser Teilmengen wurden 20µl Hoechst33342 zugesetzt und eine Stunde auf dem Wärmeblock bei 37°C inkubiert. Die anderen fünf

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Proben wurden ebenfalls 20min auf dem Wärmeblock gelagert, bevor die Untersuchungen für den 0h Wert für ATP-Gehalt, MMP, Motilität und Morphologie durchgeführt wurden. Nach drei und sechs Stunden wurden erneut ATP-Gehalt, Motilität und MMP ermittelt.

Nach der einstündigen Inkubation wurden die angefärbten Proben für den Sortiervorgang vorbereitet. Als erstes wurde die Versuchsgruppe sortiert, bei der die Amplitudenspannung für den Piezokristall von 30 Volt auf ein Minimum von 3 Volt reduziert wurde. Im Anschluss wurde die Kontrollgruppe der nach dem Standardprotokoll sortierten Spermien erstellt. Beide Gruppen wurden direkt nach dem Sortiervorgang mittels Sexcess® auf eine Endkonzentration von 10x10⁶Spermien/ml verdünnt und bei 37°C unter Lichtabschluss gelagert. Nach 20min der Temperaturanpassung wurde der 0h Wert für die Versuchsgruppen für den ATP-Gehalt, die Motilität, das MMP und die Morphologie erhoben. Nach drei und sechs Stunden wurden erneut der ATP-Gehalt, die Motilität und das MMP gemessen.

3.2.7 Versuch 7: Einfluss der Laserexposition auf die Motilitätsparameter von geschlechtsspezifisch differenzierter Spermien

Das Ejakulat eines Bullen wurde mittels Sexcess-Sample® in 15 Aliquots mit je einem Milliliter Gesamtvolumen und einer Konzentration von 100x10⁶ Spermien/ml verdünnt. Die Lagerung erfolgte bei 37°C. Zehn der 15 Proben wurde 20µl Hoechst 33342 zugesetzt und für eine Stunde unter Lichtabschluss auf dem Wärmeblock inkubiert. Die restlichen fünf Proben wurden mit Sexcess-Sample® auf eine Konzentration von 10x10⁶Spermien/ml verdünnt. Nach 20min Anpassungszeit bei 37°C wurden von diesen unbehandelten Kontrollproben ATP-Gehalt, Motilität, MMP und morphologischen abweichende Spermienformen bestimmt, welches gleichfalls als 0h Wert für die Kontrollgruppe galt. Erneute Messungen erfolgten nach drei und sechs Stunden.

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Die gefärbten und inkubierten Proben wurden für das Sortieren vorbereitet. In der Versuchsgruppe wurde der Laser ausgeschaltet und die Spermien somit der Laserexposition entzogen. Sie wurden in einem 50ml Röhrchen (Greiner, Nürtingen, Deutschland), in dem 500µl TEST-TRIS-Eigelb-Puffer als Auffangmedium vorgelegt war, aufgefangen. Im Anschluss wurden die beiden sortierten Versuchsgruppen jeweils auf 10x10⁶Spermien/ml mit Sexcess® verdünnt und unter Lichtentzug bei 37°C gelagert. Nach 20min Anpassungszeit wurde der 0h Wert ermittelt (ATP-Gehalt, Motilität, MMP, Morphologie), nach 3h und 6h wurden ebenfalls ATP-(ATP-Gehalt, Motilität und MMP bestimmt.

3.3 Statistische Auswertung

Für die statistische Auswertung wurden die Programme „SigmaStat 2.0 for Windows®“ (Jandel Scientific Cooperation, San Rafael, CA, USA) und SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) genutzt. Die Ergebnisse aus dem Versuchen 1, 2 und 3 wurden auf Normalverteilung geprüft und mittels One-Way-ANOVA oder One-Way ANOVA on Ranks ausgewertet. Wurde eine One-Way ANOVA durchgeführt, so erfolgte die statistische Bewertung auf Signifikanz mittels des Tukey-Tests. Kamen bei nicht normal verteilten Daten eine One-Way ANOVA on Ranks zum Einsatz, so wurde für die Varianzanalyse ein Kruskal-Wallis-Test durchgeführt. Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen wurden bei einer Überschreitungswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 als signifikant angesehen.

Die Daten aus den Versuchen 4, 5, 6 und 7 wurden mit Hilfe eines gemischten linearen Modells (SAS Prozedur „mixed“) ausgewertet, um die wiederholten Messungen pro Ejakulat im Thermoresistenz (Zeit und Behandlung) zu berücksichtigen. Bulle, Behandlung und Zeit sowie deren Interaktion wurden als fixe Effekte in das Modell aufgenommen. Die Residuen waren normalverteilt (Tukey-Kramer Test). Der Einfluss eines Effektes wurde bei einer

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Überschreitungswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 als signifikant angesehen (SAS 9.2 Help and Documentation, SAS Institute Inc., Cary, NC, 2008).

Yijkl= µ + Bullei + Behandlungj + Zeitk + eijkl wobei

Yijkl = Beobachtungswert µ = Populationsmittel

Bullei = fixer Effekt des Bullen (i=1-4) Behandlungj = fixer Effekt der Behandlung (j=1-3) Zeitk = fixer Effekt der Zeit (k=1-3)

eijkl = zufälliger Restfehler

Bei allen Tabellen wurde der Mittelwert als und die Standardabweichung (±SD) angegeben.

49 4. Ergebnisse

4.1 Versuch 1: Verringerung der eingesetzten Spermienkonzentration zur Bestimmung des ATP-Gehaltes und der Einfluss auf die Motilität

Die Gesamtmotilität zeigte signifikante Abweichungen (p ≤ 0,05) zwischen den Verdünnungsstufen 20x10⁶ Spermien/ml und 5x10⁶ Spermien/ml und auch zwischen

Die Gesamtmotilität zeigte signifikante Abweichungen (p ≤ 0,05) zwischen den Verdünnungsstufen 20x10⁶ Spermien/ml und 5x10⁶ Spermien/ml und auch zwischen

Im Dokument Luminometrische Verlaufskontrolle des ATP-Gehaltes von flowzytometrisch geschlechtsdifferenzierten bovinen Spermien (Seite 47-0)