4. Ergebnisse
5.7 Abschließende Beurteilung
Die Lumineszenzmessung ist eine schnelle und effektive Bestimmung des Energiestatus von Spermien (MÖNCH-TEGEDER, 2011b). Sie gibt Aufschluss über den Energiestoffwechsel der Spermien. So können Ejakulate mit einem geringen ATP-Gehalt bereits vor dem Sortierprozess selektiert werden, da die Qualität des Ausgangsejakulates einen hohen Einfluss auf den ATP-Gehalt und die
88
Lebensfähigkeit der Spermien nach dem Sortiervorgang haben (MÖNCH-TEGEDER, 2011a). Zudem ist die Lumineszenzbestimmung eine robuste Methode, die die Laborroutine durch ihre geringe Störanfälligkeit ergänzen kann.
In vielen Untersuchungen wurde gezeigt, dass gesortetes Sperma eine geringere Lebensdauer als unsortiertes Sperma besitzt (SEIDEL undJOHNSON,1999,RATH et al., 2003B, KLINC, 2005, SPINACI et al., 2005). Gesextes Sperma hat durch die gleichzeitige Selektion auf intakte Spermien eine hohe Gesamtmotilität, aber der ATP-Gehalt lässt darauf schließen, dass der Energiehaushalt durch den Sortierprozess herabgesetzt wird. Während die Standardmotilitätsparameter kaum eine direkte Aussage bezüglich des Energiehaushaltes der Spermien zulassen, zeigt die Lumineszenzmessung einen herabgesetzten ATP-Gehalt bereits bei geringeren Änderungen an und gibt Hinweise auf die Lebensfähigkeit der Spermien.
Weitere Verarbeitungsschritte des Sortierprozesses können Beschädigungen an den Spermien hervorrufen. Diese sind zum Beispiel mechanische Scherkräfte, die während der Passage des Sortiergerätes die Spermien beeinträchtigen oder auch die Höhe des Druckes, mit dem die Spermien durch den Sorter geleitet werden um dann mit einer Geschwindigkeit von ca. 50 km/h in das Sammelgefäß befördert zu werden. Zusätzlich kann auch die abschließende Zentrifugation die Lebensfähigkeit der Spermien negativ beeinflussen (MAXWELL undJOHNSON,1999,RATH et al.,2013).
Diese Bearbeitungsschritte gilt es im Hinblick auf die Integrität des Schwanzmittelstücks der Spermien durch ATP-Messung und Standardmotilitätswerte weiter zu analysieren. Die ATP-Messung gibt auch bereits vor einem Thermoresistenztest eine Aussage über den Energiestatus der gesorteten Spermien im Vergleich zur unbehandelten Gruppe an. SUH et al. (2005) konnten zeigen, dass durch die Deaktivierung des piezoelektrischen Kristalls, welcher zur Vereinzelung der Spermien im Sortierprozess benötigt wird, die Lebensfähigkeit der Spermien erhöht werden kann. Die Vereinzelung der Spermien im Flüssigkeitsstrom sowie Scherkräfte während der hydrodynamischen Fokussierung, stellen weitere Stationen im Sortierprozess dar, die durch die ATP Messungen als verbesserungswürdig identifiziert wurden. Der hier verwendete Verdünner Sexcess® wurde speziell für die
89
Behandlung von gesorteten Spermien entwickelt und zeigte in anderen Untersuchungen bereits seine positiven Eigenschaften (KLINC, 2005, MÖNCH -TEGEDER, 2011a). Die Bestimmung des ATP-Gehaltes ist auch in Verdünnern mit oben genannten Zusätzen ohne Beeinträchtigung der Lumineszenzmessung möglich. Ihr Vorteil liegt darin, dass im Vergleich zur CASA-Messung und Ermittlung des MMP kein weiterer Farbstoffzusatz nötig ist, der die Funktionalität der Spermien negativ beeinflussen könnte.
90 6. Zusammenfassung
Stephanie Sander
Luminometrische Verlaufskontrolle des ATP-Gehaltes von flowzytometrisch geschlechtsdifferenzierten bovinen Spermien
Die momentan einzige Möglichkeit, Spermien mit einer hohen Exaktheit nach ihren geschlechtsbestimmenden Eigenschaften zu sortieren, ist die Beltsville Sperm Sexing Technology® mittels Flowzytometrie. Obwohl diese Technik zuverlässig ist und in der Rinderzucht mittlerweile kommerziell genutzt wird, variiert die Qualität des gesexten Spermas nicht nur zwischen verschiedenen Bullen, sondern auch zwischen unterschiedlichen Ejakulaten. In dieser Arbeit wurde der Energiehaushalt der Spermien mittels eines ATP-Lumineszenz-Testes untersucht, um Stressfaktoren während des Sortierprozesses auf die Mitochondrien nachzuweisen. Dazu wurden verschiedene Schritte des Sortingprozesses, im Besonderen der Effekt durch den Hoechst 33342 Farbstoff, die elektrische Spannung, die elektrostatische Ablenkung und die Laserexposition im Vergleich zwischen unsortiertem und sortiertem Sperma untersucht.
Ergebnisse: Die geschlechtsspezifische Sortierung von Spermien im Flowzytometer hat einen signifikanten negativen Einfluss auf ihren ATP-Gehalt, obwohl die Motilität nach dem Sortieren zunächst erhöht ist, was auf die Hyperaktivierung durch die beginnende Kapazitation und die Selektion von membranintakten Spermien zurück zu führen ist. Ein positiver Effekt auf den ATP-Gehalt der Spermien und ihre Motilität wurde durch den Einsatz des Sexcess® Verdünners erzielt. Weder die Anfärbung mit Hoechst 33342 noch die Minimierung der mechanischen Kräfte des Piezokristalls auf den Flüssigkeitsstrom der Spermien bewirkte signifikante Veränderungen in Bezug
91
auf den Energiegehalt. Die Deaktivierung der elektrostatischen Ablenkung führte zu einer geringeren ATP-Produktion, welches der fehlenden Hyperaktivierung zuzuschreiben ist. Der ATP-Gehalt und die Gesamtmotilität der Versuchsgruppe, die ohne Laser den Sorter passiert hatte, waren signifikant geringer im Vergleich zur standardsortierten Gruppe. Ohne den Laser konnte ein aussortieren der membrandefekten Spermien nicht stattfinden, was zu einem insgesamt geringeren ATP-Gehalt dieser Versuchsgruppe führte.
Zusammenfassend ergibt sich, dass die Bestimmung des ATP-Gehaltes die Motilitätsdiagnose mittels CASA-System ergänzen kann und eine frühe Aussage zum Energiehaushalt der eingesetzten Spermien zulässt.
92 7. Summary
Stephanie Sander
Luminometric study of the ATP-content in flow cytometrically sorted bovine sperm
So far, only Beltsville Sperm Sexing Technology® based on flow cytometry is able to separate X- and Y- chromosome bearing sperm with high accuracy. Although the technique is reliable and has been introduced into bovine breeding strategies, qualities of sorted sperm vary not only among bulls but also among ejaculates. As standard sperm quality assessments do not allow a secure prediction of whether sorted sperm are fully fertile, it is necessary to include further sensitive methods to predict fertility. Therefore, the energy balance was tested by a recently developed luminescence ATP test to identify stress factors on sperm mitochondria during different steps of flow cytometrical sorting. Especially, effects of Hoechst 33342 dye, piezo crystal forces, electrostatic deflection, and laser exposure were studied and compared to non-sorted and standard sorted sperm.
Results: The sorting process has a significant negative impact on the ATP content of sorted sperm. However motility was increased significantly after sorting mainly due to hyperactivation caused by capacitation and presumably by selection of membrane intact and viable sperm during the sorting process. A positive effect on ATP content and motility was also seen, when sperm were processed in Sexcess® catch fluid and diluter. The use of Hoechst 33342 as well as minimzed forces caused by the piezo crystal movements did not show any significant effect on the energy release and sperm motility. The deactivation of the electrical deflection kept ATP production on a low level, presumably due to absence of hyper activation. All over ATP production
93
and degree of motility in sperm passing the sorter with deactivated laser was significantly lower as compared to the normal sorted group. With a deactivated laser not only sex related sorting is impossible, separation of membrane defect sperm will not take place and reduce the mean ATP content of the total sperm group.
In conclusion, the measurement of ATP content supplements the motility diagnostic of CASA-systems and provides an early judgement of the energy balance and the lifespan of sex sorted bovine sperm.
94 8. Literaturverzeichnis
AITKEN, R. J. 1995. Free radicals, lipid peroxidation and sperm function. Reprod Fertil Dev, 7, 659-68.
AITKEN, R. J., CLARKSON, J. S. & FISHEL, S. 1989a. Generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation, and human sperm function. Biol Reprod, 41, 183-97.
AITKEN, R. J., CLARKSON, J. S., HARGREAVE, T. B., IRVINE, D. S. & WU, F. C.
1989b. Analysis of the relationship between defective sperm function and the generation of reactive oxygen species in cases of oligozoospermia. J Androl, 10, 214-20.
ALVAREZ, J. G., TOUCHSTONE, J. C., BLASCO, L. & STOREY, B. T. 1987.
Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human spermatozoa. Superoxide dismutase as major enzyme protectant against oxygen toxicity. J Androl, 8, 338-48.
AMARAL, A., LOURENCO, B., MARQUES, M. & RAMALHO-SANTOS, J. 2013.
Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction, 146, R163-74.
ARMSTRONG, J. S., RAJASEKARAN, M., CHAMULITRAT, W., GATTI, P., HELLSTROM, W. J. & SIKKA, S. C. 1999. Characterization of reactive oxygen species induced effects on human spermatozoa movement and energy metabolism. Free Radic Biol Med, 26, 869-80.
AUGER, J., RONOT, X. & DADOUNE, J. P. 1989. Human sperm mitochondrial function related to motility: a flow and image cytometric assessment. J Androl, 10, 439-48.
AUSTIN, C. R. 1952. The capacitation of the mammalian sperm. Nature, 170, 326.
BALAO DA SILVA, C. M., ORTEGA FERRUSOLA, C., MORILLO RODRIGUEZ, A., GALLARDO BOLANOS, J. M., PLAZA DAVILA, M., MORRELL, J. M., RODRIGUEZ MARTINEZ, H., TAPIA, J. A., APARICIO, I. M. & PENA, F. J.
2013. Sex sorting increases the permeability of the membrane of stallion spermatozoa. Anim Reprod Sci, 138, 241-51.
95
BANSAL, A. K. & BILASPURI, G. S. 2010. Impacts of oxidative stress and antioxidants on semen functions. Vet Med Int, 2010.
BAUMBER, J., SABEUR, K., VO, A. & BALL, B. A. 2003. Reactive oxygen species promote tyrosine phosphorylation and capacitation in equine spermatozoa.
Theriogenology, 60, 1239-47.
BILODEAU, J. F., BLANCHETTE, S., CORMIER, N. & SIRARD, M. A. 2002.
Reactive oxygen species-mediated loss of bovine sperm motility in egg yolk Tris extender: protection by pyruvate, metal chelators and bovine liver or oviductal fluid catalase. Theriogenology, 57, 1105-22.
BILODEAU, J. F., CHATTERJEE, S., SIRARD, M. A. & GAGNON, C. 2000. Levels of antioxidant defenses are decreased in bovine spermatozoa after a cycle of freezing and thawing. Mol Reprod Dev, 55, 282-8.
BISHOP, D. W. 1962. Sperm motility. Physiol Rev, 42, 1-59.
BOLLWEIN, H., FUCHS, I. & KOESS, C. 2008. Interrelationship between plasma membrane integrity, mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation in cryopreserved bovine spermatozoa. Reprod Domest Anim, 43, 189-95.
BROOKS, D. E. 1970. Observations on the content of ATP and ADP in bull spermatozoa using the firefly luciferase system. J Reprod Fertil, 23, 525-8.
BUCAK, M. N., TUNCER, P. B., SARIOZKAN, S., BASPINAR, N., TASPINAR, M., COYAN, K., BILGILI, A., AKALIN, P. P., BUYUKLEBLEBICI, S., AYDOS, S., ILGAZ, S., SUNGUROGLU, A. & OZTUNA, D. 2010. Effects of antioxidants on post-thawed bovine sperm and oxidative stress parameters: antioxidants protect DNA integrity against cryodamage. Cryobiology, 61, 248-53.
BUCHANAN, B. R., SEIDEL, G. E., JR., MCCUE, P. M., SCHENK, J. L., HERICKHOFF, L. A. & SQUIRES, E. L. 2000. Insemination of mares with low numbers of either unsexed or sexed spermatozoa. Theriogenology, 53, 1333-44.
BUSCH, W. & HOLZMANN, A. 2001. Veterinärmedizinische Andrologie: Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung bei männlichen Tieren, Schattauer Verlag.
BUSCH, W. & WABERSKI, D. 2007. Künstliche Besamung bei Haus-und Nutztieren:
mit 72 Tabellen;[abgestimmt auf das neue Tierzuchtgesetz 2006], Schattauer Verlag.
96
CALISICI, O. 2010. Investigation of antioxidative capacity in bovine seminal plasma–
Effects of Omega-3 fatty acids. Hannover, Tierärztliche Hochsch., Diss., 2010.
CARLSON, D., BLACK, D. L. & HOWE, G. R. 1970. Oviduct secretion in the cow. J Reprod Fertil, 22, 549-52.
CASCIERI, M., AMANN, R. P. & HAMMERSTEDT, R. H. 1976. Adenine nucleotide changes at initiation of bull sperm motility. J Biol Chem, 251, 787-93.
CATT, S. L., SAKKAS, D., BIZZARO, D., BIANCHI, P. G., MAXWELL, W. M. &
EVANS, G. 1997. Hoechst staining and exposure to UV laser during flow cytometric sorting does not affect the frequency of detected endogenous DNA nicks in abnormal and normal human spermatozoa. Mol Hum Reprod, 3, 821-5.
CENTURION, F., VAZQUEZ, J. M., CALVETE, J. J., ROCA, J., SANZ, L., PARRILLA, I., GARCIA, E. M. & MARTINEZ, E. A. 2003. Influence of porcine spermadhesins on the susceptibility of boar spermatozoa to high dilution. Biol Reprod, 69, 640-6. quantitative estimate of fertilizing potential. Fertil Steril, 40, 500-4.
CONTRI, A., VALORZ, C., FAUSTINI, M., WEGHER, L. & CARLUCCIO, A. 2010.
Effect of semen preparation on casa motility results in cryopreserved bull spermatozoa. Theriogenology, 74, 424-35.
COSSARIZZA, A., BACCARANI-CONTRI, M., KALASHNIKOVA, G. &
FRANCESCHI, C. 1993. A new method for the cytofluorimetric analysis of mitochondrial membrane potential using the J-aggregate forming lipophilic cation 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1). Biochem Biophys Res Commun, 197, 40-5.
COSSARIZZA, A., CECCARELLI, D. & MASINI, A. 1996. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Exp Cell Res, 222, 84-94.
97
CROSS, A. R. & JONES, O. T. 1991. Enzymic mechanisms of superoxide production. Biochim Biophys Acta, 1057, 281-98.
DAWSON, A. 1979. Oxidation of cytosolic NADH formed during aerobic metabolism in mammalian cells. Trends in Biochemical Sciences, 4, 171-176.
DE AMBROGI, M., SPINACI, M., GALEATI, G. & TAMANINI, C. 2006. Viability and DNA fragmentation in differently sorted boar spermatozoa. Theriogenology, 66, 1994-2000.
OOSTHUIZEN, J. M. 1993. Differential sperm motility scoring and sperm ATP concentrations. Arch Androl, 30, 69-71.
ERBA, E., UBEZIO, P., BROGGINI, M., PONTI, M. & D'INCALCI, M. 1988. DNA damage, cytotoxic effect and cell-cycle perturbation of Hoechst 33342 on L1210 cells in vitro. Cytometry, 9, 1-6.
ERICSSON, S. A., GARNER, D. L., THOMAS, C. A., DOWNING, T. W. &
MARSHALL, C. E. 1993. Interrelationships among fluorometric analyses of spermatozoal function, classical semen quality parameters and the fertility of frozen-thawed bovine spermatozoa. Theriogenology, 39, 1009-24.
FAWCETT, D. W. 1970. A comparative view of sperm ultrastructure. Biol Reprod, 2, Suppl 2:90-127.
FOULKES, J. A. & MACDONALD, B. J. 1979. The relationship between ATP content and motility of bovine spermatozoa. Theriogenology, 11, 313-9.
98
FRIJTERS, A. C., MULLAART, E., ROELOFS, R. M., VAN HOORNE, R. P., MORENO, J. F., MORENO, O. & MERTON, J. S. 2009. What affects fertility of sexed bull semen more, low sperm dosage or the sorting process?
Theriogenology, 71, 64-7.
GARNER, D., SCHENK, J. & SEIDEL JR, G. Chromatin stability in sex-sorted sperm.
VII International Congress of Andrology, 2001a.
GARNER, D. & SEIDEL JR, G. 2003. Past, present and future perspectives on sexing sperm. Canadian journal of animal science, 83, 375-384.
GARNER, D. L. 2006. Flow cytometric sexing of mammalian sperm. Theriogenology, 65, 943-57.
GARNER, D. L., GLEDHILL, B. L., PINKEL, D., LAKE, S., STEPHENSON, D., VAN DILLA, M. A. & JOHNSON, L. A. 1983. Quantification of the X- and Y-chromosome-bearing spermatozoa of domestic animals by flow cytometry.
Biol Reprod, 28, 312-21.
GARNER, D. L., THOMAS, C. A., GRAVANCE, C. G., MARSHALL, C. E., DEJARNETTE, J. M. & ALLEN, C. H. 2001b. Seminal plasma addition attenuates the dilution effect in bovine sperm. Theriogenology, 56, 31-40.
GARNER, D. L., THOMAS, C. A., JOERG, H. W., DEJARNETTE, J. M. &
MARSHALL, C. E. 1997. Fluorometric assessments of mitochondrial function and viability in cryopreserved bovine spermatozoa. Biol Reprod, 57, 1401-6.
GARRETT, L. J., REVELL, S. G. & LEESE, H. J. 2008. Adenosine triphosphate production by bovine spermatozoa and its relationship to semen fertilizing ability. J Androl, 29, 449-58.
GOTTLIEB, C., SVANBORG, K., ENEROTH, P. & BYGDEMAN, M. 1987. Adenosine triphosphate in human semen: a study on conditions for a bioluminescence assay. Fertil Steril, 47, 992-9.
GRAVANCE, C. G., GARNER, D. L., MILLER, M. G. & BERGER, T. 2001.
Fluorescent probes and flow cytometry to assess rat sperm integrity and mitochondrial function. Reprod Toxicol, 15, 5-10.
GROSSFELD, R., SIEG, B., STRUCKMANN, C., FRENZEL, A., MAXWELL, W. M. &
RATH, D. 2008. New aspects of boar semen freezing strategies.
Theriogenology, 70, 1225-33.
99
GUTHRIE, H. D., JOHNSON, L. A., GARRETT, W. M., WELCH, G. R. &
DOBRINSKY, J. R. 2002. Flow cytometric sperm sorting: effects of varying laser power on embryo development in swine. Mol Reprod Dev, 61, 87-92.
GUTHRIE, H. D. & WELCH, G. R. 2008. Determination of high mitochondrial membrane potential in spermatozoa loaded with the mitochondrial probe 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine iodide (JC-1) by using fluorescence-activated flow cytometry. Methods Mol Biol, 477, 89-97.
HALANGK, W., BOHNENSACK, R. & KUNZ, W. 1985. Interdependence of mitochondrial ATP production and extramitochondrial ATP utilization in intact spermatozoa. Biochim Biophys Acta, 808, 316-22.
HALLAP, T., NAGY, S., JAAKMA, U., JOHANNISSON, A. & RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. 2005. Mitochondrial activity of frozen-thawed spermatozoa assessed by MitoTracker Deep Red 633. Theriogenology, 63, 2311-22.
HAMMERSTEDT, R. H. & AMANN, R. P. 1976. Effects of physiological levels of exogenous steroids on metabolism of testicular, cauda epididymal and ejaculated bovine sperm. Biol Reprod, 15, 678-85.
HAMMERSTEDT, R. H. & HAY, S. R. 1980. Effect of incubation temperature on motility and cAMP content of bovine sperm. Arch Biochem Biophys, 199, 427-37.
HAMMERSTEDT, R. H. & LARDY, H. A. 1983. The effect of substrate cycling on the ATP yield of sperm glycolysis. J Biol Chem, 258, 8759-68.
HAMMERSTEDT, R. H., VOLONTE, C. & RACKER, E. 1988. Motility, heat, and lactate production in ejaculated bovine sperm. Arch Biochem Biophys, 266, 111-23.
HO, H. C. & SUAREZ, S. S. 2001. Hyperactivation of mammalian spermatozoa:
function and regulation. Reproduction, 122, 519-26.
HOLLINSHEAD, F. K., GILLAN, L., O'BRIEN, J. K., EVANS, G. & MAXWELL, W. M.
2003. In vitro and in vivo assessment of functional capacity of flow cytometrically sorted ram spermatozoa after freezing and thawing. Reprod Fertil Dev, 15, 351-9.
HOSKINS, D. D. 1973. Adenine nucleotide mediation of fructolysis and motility in bovine epididymal spermatozoa. J Biol Chem, 248, 1135-40.
100
HUTSON, S. M., VAN DOP, C. & LARDY, H. A. 1977. Mitochondrial metabolism of pyruvate in bovine spermatozoa. J Biol Chem, 252, 1309-15.
ICHIKAWA, T., OEDA, T., OHMORI, H. & SCHILL, W. B. 1999. Reactive oxygen species influence the acrosome reaction but not acrosin activity in human spermatozoa. Int J Androl, 22, 37-42.
INSKEEP, P. B. & HAMMERSTEDT, R. H. 1985. Endogenous metabolism by sperm in response to altered cellular ATP requirements. J Cell Physiol, 123, 180-90.
ISHIKAWA, S., YANO, Y., ARIHARA, K. & ITOH, M. 2004. Egg yolk phosvitin inhibits hydroxyl radical formation from the fenton reaction. Biosci Biotechnol Biochem, 68, 1324-31.
IWASAKI, A. & GAGNON, C. 1992. Formation of reactive oxygen species in spermatozoa of infertile patients. Fertil Steril, 57, 409-16.
JANUSKAUSKAS, A. & RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. 1995. Assessment of sperm viability by measurement of ATP, membrane integrity and motility in frozen/thawed bull semen. Acta Vet Scand, 36, 571-4.
JEULIN, C. & SOUFIR, J. C. 1992. Reversible intracellular ATP changes in intact rat spermatozoa and effects on flagellar sperm movement. Cell Motil Cytoskeleton, 21, 210-22. chromosome-bearing sperm for DNA using an improved preparation method and staining with Hoechst 33342. Gamete Res, 17, 203-12.
JOHNSON, L. A. & PINKEL, D. 1986. Modification of a laser-based flow cytometer for high-resolution DNA analysis of mammalian spermatozoa. Cytometry, 7, 268-73.
JOHNSON, L. A. & WELCH, G. R. 1999. Sex preselection: high-speed flow cytometric sorting of X and Y sperm for maximum efficiency. Theriogenology, 52, 1323-41.
101
JOHNSON, L. A., WELCH, G. R. & RENS, W. 1999. The Beltsville sperm sexing technology: high-speed sperm sorting gives improved sperm output for in vitro fertilization and AI. J Anim Sci, 77 Suppl 2, 213-20.
KÄHN, W., PFETSCH, J. & LEIDL, W. 1982. ATP‐, ADP‐und AMP‐Gehalt von Spermien einiger Haustiere und des Menschen sowie von Bullenspermien während der Tiefgefrierkonservierung. Reproduction in Domestic Animals, 17, 49-55.
KISSEL, G. 2009. Untersuchungen zur Zytoprotektion bei der Anwendung von Wundantiseptika mittels Lumineszenzmessung und Durchflusszytometrie.
KLINC, P. 2005. Improved fertility of flowcytometrically sex selected bull spermatozoa. Tierarztliche Hochschule.
KLINC, P., FRESE, D., OSMERS, H. & RATH, D. 2007. Insemination with sex sorted fresh bovine spermatozoa processed in the presence of antioxidative substances. Reprod Domest Anim, 42, 58-62.
KLINC, P. & RATH, D. 2005. State of the art and perspectives of application of sorted sperm cells in farm animals. ZUCHTUNGSKUNDE, 77, 218-229.
KLINC, P. & RATH, D. 2007. Reduction of oxidative stress in bovine spermatozoa during flow cytometric sorting. Reprod Domest Anim, 42, 63-7.
KOKSAL, I. T., USTA, M., ORHAN, I., ABBASOGLU, S. & KADIOGLU, A. 2003.
Potential role of reactive oxygen species on testicular pathology associated with infertility. Asian J Androl, 5, 95-9.
KRAUSE, D. 1966. Untersuchungen am Bullensperma unter Berücksichtigung der fertilitätsdiagnostischen Bedeutung der Befunde [Habilitations-Schrift].
Tierärztliche Hochschule, Hannover.
KRICKA, L. J. & STANLEY, P. E. 1992. Bioluminescence and chemiluminescence literature. The 1982 literature: Part I. J Biolumin Chemilumin, 7, 143-55.
KRZYZOSIAK, J., MOLAN, P. & VISHWANATH, R. 1999. Measurements of bovine sperm velocities under true anaerobic and aerobic conditions. Anim Reprod Sci, 55, 163-73.
LEAHY, T., CELI, P., BATHGATE, R., EVANS, G., MAXWELL, W. M. & MARTI, J. I.
2010. Flow-sorted ram spermatozoa are highly susceptible to hydrogen
102
peroxide damage but are protected by seminal plasma and catalase. Reprod Fertil Dev, 22, 1131-40.
LOEFFLER, K. & GÄBEL, G. 2013. Anatomie und Physiologie der Haustiere, UTB.
LONG, J. A. & GUTHRIE, H. D. 2006. Validation of a rapid, large-scale assay to quantify ATP concentration in spermatozoa. Theriogenology, 65, 1620-30.
LU, C. L. & BAKER, R. C. 1986. Characteristics of egg yolk phosvitin as an antioxidant for inhibiting metal-catalyzed phospholipid oxidations. Poult Sci, 65, 2065-70.
LUNDIN, A. 1982. Analytical applications of bioluminescence: the firefly system.
Clinical and biochemical luminescence. Dekker, New York, 43-74.
LUNDIN, A. 2000. Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Methods Enzymol, 305, 346-70.
LUO, S. M., SCHATTEN, H. & SUN, Q. Y. 2013. Sperm mitochondria in reproduction:
good or bad and where do they go? J Genet Genomics, 40, 549-56.
MAHMOUD, A. M., COMHAIRE, F. H., VERMEULEN, L. & ANDREOU, E. 1994.
Comparison of the resazurin test, adenosine triphosphate in semen, and various sperm parameters. Hum Reprod, 9, 1688-93.
MAJUMDER, G. C., DEY, C. S., HALDAR, S. & BARUA, M. 1990. Biochemical parameters of initiation and regulation of sperm motility. Arch Androl, 24, 287-303.
MANN, T. 1964. Spermatozoa: Structural and functional characteristics; motility and fertility. The biochemistry of semen and of the male reproductive tract. John Wiley-Sons Inc, 20.
MANN, T. & LUTWAK-MANN, C. 1981. Biochemistry of Spermatozoa: Chemical and Functional Correlations in Ejaculated Semen, Andrological Aspect. Male Reproductive Function and Semen. Springer.
MANNELLA, C. A. 2008. Structural diversity of mitochondria: functional implications.
Ann N Y Acad Sci, 1147, 171-9.
MAXWELL, W. M., EVANS, G., HOLLINSHEAD, F. K., BATHGATE, R., DE GRAAF, S. P., ERIKSSON, B. M., GILLAN, L., MORTON, K. M. & O'BRIEN, J. K. 2004.
103
Integration of sperm sexing technology into the ART toolbox. Anim Reprod Sci, 82-83, 79-95.
MAXWELL, W. M. & JOHNSON, L. A. 1999. Physiology of spermatozoa at high dilution rates: the influence of seminal plasma. Theriogenology, 52, 1353-62.
MAXWELL, W. M., LONG, C. R., JOHNSON, L. A., DOBRINSKY, J. R. & WELCH, G. R. 1998. The relationship between membrane status and fertility of boar spermatozoa after flow cytometric sorting in the presence or absence of seminal plasma. Reprod Fertil Dev, 10, 433-40.
MAXWELL, W. M., WELCH, G. R. & JOHNSON, L. A. 1996. Viability and membrane integrity of spermatozoa after dilution and flow cytometric sorting in the presence or absence of seminal plasma. Reprod Fertil Dev, 8, 1165-78.
MCELROY, W. D. 1947. The Energy Source for Bioluminescence in an Isolated System. Proc Natl Acad Sci U S A, 33, 342-5.
MCNUTT, T. & JOHNSON, L. 1996. Electrophoretic gel analysis of Hoechst 33342 stained and flow cytometrically sorted bovine sperm membrane proteins.
Reproduction in Domestic Animals, 31, 703-709.
MENDELUK, G. R., MUNUCE, M. J., CARIZZA, C., SARDI, M. & BREGNI, C. 1997.
Sperm motility and ATP content in seminal hyperviscosity. Arch Androl, 39, 223-7.
MILLER, J. K., BRZEZINSKA-SLEBODZINSKA, E. & MADSEN, F. C. 1993.
Oxidative stress, antioxidants, and animal function. J Dairy Sci, 76, 2812-23.
MINELLI, A., MORONI, M., CASTELLINI, C., LATTAIOLI, P., MEZZASOMA, I. &
RONQUIST, G. 1999. Rabbit spermatozoa: a model system for studying ATP homeostasis and motility. J Androl, 20, 259-66.
MITCHELL, P. 1961. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature, 191, 144-8.
MÖNCH-TEGEDER, G. 2011a. Einfluss verschiedener Ejakulatbehandlungen auf die Lebensfähigkeit und das Befruchtungspotential geschlechtsspezifisch differenzierter Bullenspermien, Cuvillier.
MÖNCH-TEGEDER, M. 2011b. Etablierung eines ATP-Tests zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Bullenspermien. Masterarbeit, Georg-August-Universität Göttingen.
104
MONTAG, M., RINK, K., DELACRETAZ, G. & VAN DER VEN, H. 2000.
MONTAG, M., RINK, K., DELACRETAZ, G. & VAN DER VEN, H. 2000.