SGT setzt sich aus mehr als drei Polypeptidformen zusammen

Da bislang die Auftrennung von SGT nur in 1D-PAGE untersucht wurde, sollte zunächst das Muster der SGT-Polypeptide in Abwesenheit von NS1 in 2D-PAGE analysiert werden. Zu diesem Zweck wurden 293T-Zellen mit 9M Harnstoff lysiert bzw. aufgeschlossen und die Proteine in 2D-PAGE aufgetrennt. Die Auftrennung erfolgte in der ersten Dimension zunächst in einem pH-Bereich zwischen 3 und 11 und in der zweiten Dimension in einem 10% PAA-Gel. Da sich zeigte, dass alle SGT-Polypeptide immer in einem Bereich zwischen pH 4 und 7 nachgewiesen werden konnten (Daten nicht gezeigt), wurde im folgenden immer eine Auf-trennung in diesem pH-Bereich vorgenommen. Die SGT-Polypeptidformen wurden anschlies-send durch Western Blot mit einem hSGT-spezifischen Antikörper nachgewiesen.

Im Gegensatz zur 1D-Analyse in der nur drei SGT-Polypeptidfraktionen nachweisbar waren (Abb. 4-8A, ohne NS1), ließen sich in Abwesenheit von NS1 in der 2D-Analyse elf verschie-dene SGT-Polypeptidformen nachweisen (Abb. 4-10A; mock). Zur besseren Orientierung sind diese SGT-Polypeptidformen in der Abb. 4-10B (mock) schematisch dargestellt und numme-riert. Alle Polypeptidformen hatten ein Molekulargewicht zwischen 36kDa und 39kDa und lagen in einem sauren pH-Bereich zwischen 4.6-5.3. Diese Werte stimmten sehr gut mit dem theoretischen aus der AA-Sequenz berechneten isoelektrischen Punkt des SGT-Proteins über-ein, der bei 4.62 liegt. Alle Polypeptidformen lagen eng beieinander. Da die vertikale Auf-trennung in der 2D-Analyse nicht so gut ist wie in einer 1D-Analyse, ist es schwierig, die SGT-Polypeptidformen den in der 1D-Analyse nachweisbaren drei SGT-Polypeptifraktionen (Abb. 4-8A, ohne NS1) zuzuordnen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die in grauer Farbe dar-gestellten Polypeptidformen (1-5) zu der in der 1D-PAGE nachweisbaren Polypeptidfraktion A (36kDa) gehören, während die in blauer (6-8) und in gelber Farbe (9-11) dargestellten Po-lypeptidformen den Polypeptidfraktionen B bzw. C (38kDa bzw. 39kDa) zugeordnet werden

Ergebnisse 75

können. Die Polypeptide 6-11 lagen in einem stärker sauren Bereich als die Polypeptidformen 1 und 2, die eindeutig der Fraktion A zugeordnet werden können. Dieses Ergebnis ist im Ein-klang mit einer Auftrennung, die man bei Modifikationen durch Phosphorylierung erwartet würde, weil eine Phosphorylierung eine Verschiebung des isoelektrischen Punktes eines Pro-teins zu einem stärker sauren Bereich bewirken kann (Spector et al., 1997). Zu Fraktion A ge-hören neben den Polypeptidformen 1 und 2 wahrscheinlich auch die Polypeptidformen 3, 4 und 5, die einen niedrigeren isoelektrischen Punkt als die Polypeptide 1 und 2 zeigten. Dies könnte darauf hinweisen, dass auch diese SGT-Polypeptide durch Phosphorylierung modifi-ziert wurden. Diese Ergebnisse stimmen sehr gut mit dem Resultat des ³² P-Labeling-Experiments (Abb. 4-9) überein, in dem in allen drei 1D-Polypeptidfraktionen von SGT eine metabolische ³²P-Markierung nachgewiesen werden konnte.

Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass SGT aus mehr als drei Polypeptidformen besteht, wobei die meisten dieser Formen vermutlich phosphoryliert sind.

Abb. 4-10: Modifikation von endogenem SGT.

A: Auftrennung der SGT-Polypeptide von nicht infizierten 293T-Zellen (mock) und H1 infizierten Zellen (H1) in 2D-Western Blot-Analyse. Die Zellen wurden im Fall einer Infektion mit einer MOI von 10 infiziert. 48h später wurden die Zellen mit 9M Harnstoff aufgeschlossen. Die Proteine wurden in der ersten Dimension in einem pH-Bereich von 4 bis 7 und in der zweiten Dimension in einem 10% SDS-PAA-Gel aufgetrennt und durch Western Blot analysiert. Zur Detektion von SGT wurde als primärer Ak der SGT-spezifische AG1.1 (1:1000) und als se-kundärer Ak ein HRP-konjugierter Ziege anti-Kaninchen Ak (1:10000) verwendet. B: Schematische Darstellung der SGT-Polypeptide aus nicht infizierten Zellen (mock) oder aus infizierten Zellen (H1). Die grauen, blauen und gelben Punkte stellen die SGT-Polypeptide in mock dar. Die gelben Punkte entsprechen den SGT-Polypeptiden, die nur nach einer Infektion zusätzlich nachweisbar sind.

4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2

Ergebnisse 76 4.2.3.2 Eine H1-Infektion induziert die Entstehung neuer SGT-Polypeptidformen

Im weiteren sollten die SGT-Polypeptidformen in Gegenwart von NS1 in der 2D-Gelelektrophorese untersucht werden. Dazu wurden 293T-Zellen mit H1-infiziert und 48h später wurde die Auftrennung von SGT in 2D-PAGE wie im vorherigen Abschnitt (4.2.3.1) beschrieben analysiert.

In infizierten 293T-Zellextrakten konnten in der 2D-PAGE alle SGT-Polypeptidformen nach-gewiesen werden, wie in nicht infizierten Zellextrakten, und darüber hinaus noch vier neue Formen (Abb. 4-10; H1; 12-15). Diese Infektions-spezifischen Polypeptidformen haben ein Molekulargewicht von annähernd 39kDa und können der Polypeptidfraktion C zugeordnet werden (Abb. 4-8A; mit NS1). Ihr isoelektrischer Punkt lag in einem stärker sauren Bereich als der isoelektrische Punkt der SGT-Polypeptide aus nicht infizierten Zellen. Diese Beobach-tung wurde als Hinweis darauf gewertet, dass die Infektions-spezifischen SGT-Polypeptide durch zusätzliche Phosphorylierungen entstehen. Dieses Ergebnis bestätigte die Befunde mit FlagSGT aus in vivo ³²P-Labeling-Experimenten (Abb. 4-9), die ebenfalls auf eine Hyper-phosphorylierung der Fraktion B nach NS1-Expression schließen ließ. Außer den vier Signa-len, die von den Infektions-spezifischen Polypeptiden hervorgehen, sind noch Intensitätsunter-schiede bei anderen SGT-Polypeptidsignalen zu beobachten, die auch in nicht infizierten Zel-len nachweisbar sind. Ein Vergleich zwischen nicht infizierten und H1-infizierten ZelZel-len (Abb. 4-10) zeigte, dass die Intensität der Signale der Polypeptide 4 und 6 deutlich abnahm, während die Signale der Polypeptide 8, 10 und 11 stärker wurden. Das Polypeptid 5 war fast nicht mehr nachweisbar. Eine Intensitätsveränderung der Polypeptidsignale 1, 2, 3 und 9 konnte nicht beobachtet werden. Bei Polypeptiden 3 bis 11 war außerdem eine leichte Ver-schiebung in Richtung höheres Molekulargewicht festzustellen. Da die SGT-Polypeptide eine stufenartige Anordnung zeigten und die vertikale Auftrennung bei 2D nicht gut ist, kann über eine Zuordnung der Polypeptidsignale 1 bis 5 zur 36kDa-Bande (A) und der restlichen (6-14) zu 39kDa-Bande (C) von SGT nur spekuliert werden. Eine 2D-Analyse „gemischter Proben“, bei denen die Extrakte aus nicht infizierten und infizierten Zellen vor der Analyse vereinigt wurden, zeigte, dass die SGT-Polypeptide 1 bis 11 beider Extrakte ein identisches Laufverhal-ten aufwiesen und es sich deshalb um die jeweils selben SGT-Polypeptidformen handelte (Da-ten nicht gezeigt).

Ergebnisse 77 Diese Ergebnisse zeigten, dass bei einer Infektion zusätzliche Modifikationen an

SGT-Polypeptiden stattfinden, und sie weisen stark auf eine durch Infektion induzierte Hyperphos-phorylierung von SGT hin.