Funktionen von SGT

Da SGT ubiquitär exprimiert wird, könnte es sich um ein Housekeeping-Protein handeln. Al-lerdings zeigten sgt-Knock out-Mutanten in S. cerevisiae keine phänotypische Veränderung beim Wachstum auf Medien mit unterschiedlichen Kohlenstoffquellen. Die große Homologie von SGT innerhalb der TPR-Motive zu Hop (Hsp70 und Hsp90 organizing protein, bekannt auch als p60 oder Sti1p) legt die Vermutung nah, dass SGT eine Rolle als Co-Chaperon spie-len könnte (Scheufler et al., 2000 ).

Hop ist ein Adaptor-Protein, das die Assoziation der Chaperone Hsp70 und Hsp90 vermittelt.

Das Protein enthält neun Motive, die zwei Domänen bilden: Die N-terminale

TPR-Einleitung 22 Domäne des Hop-Proteins, TPR1 ist für die Interaktion mit dem C-Terminus von Hsp70

ver-antwortlich, wohingegen die C-terminale Domäne, TPR2, für die Bindung an Hsp90 zustän-dig ist (Chen et al., 1996; Lassle et al., 1997; Demand et al., 1998; Scheufler et al., 2000). Liu et al. (1999) haben zum ersten Mal gezeigt, dass hSGT tatsächlich über die TPR-Motive mit einem Mitglied der Hsp70-Familie, Hsc70 (heat shock cognate protein; Maekawa et al., 1989), in vitro interagiert. Chaperone der Hsp70-Familie sind beim Faltungsprozeß neu trans-latierter Proteine, bei der Translokation von Proteinen durch verschiedene zelluläre Kompar-timente, bei der Deassemblierung von Proteinkomplexen und bei der Degradation von instabi-len Proteinen involviert. Außerdem scheinen sie auch die Aktivität verschiedener regulatori-scher Proteine zu kontrollieren (Morimoto et al., 1994; Hartl, 1996; Bukau & Horwich, 1998).

Die Anwesenheit von ATP ist bei diesen Prozessen essentiell (Flynn et al., 1991; Rüdiger et al., 1997).

Eine funktionelle Relevanz des hSGT/Hsc70-Komplexes war bis vor kurzem noch nicht be-kannt. Erst letztes Jahr wurde von Tobaben et al. (2001) gezeigt, dass das hSGT eine Kompo-nente eines trimeren synaptischen ATP-abhängigen Chaperon-Komplexes darstellt. Das dritte Mitglied dieses Komplexes ist das CSP-Protein (cystein string protein). CSP ist ein Mem-bran-gebundenes Protein, das ein Cystein-Motiv (C₂X₅C₁₁X₂C₂; C steht für Cystein und X für jede beliebige AS) und eine N-terminale J-Domäne enthält (Zinsmaier et al., 1990). CSP ist zwar an synaptischen Vesikeln lokalisiert (Mastrogiacomo et al., 1994), wurde jedoch auch an anderen sekretorischen Vesikeln gefunden, was auf eine generelle Funktion des Proteins bei der Sekretionsregulation hinweist (Braun & Scheller, 1995; Chamberlain et al., 1996). Es scheint bei der Freigabe von Neurotransmittern, Hormonen und Enzym-Vorläufern eine wich-tige Rolle zu spielen (Buchner & Gundersen, 1997). Im Chaperonkomplex interagiert CSP über die J-Domäne mit Hsc70 (diese Interaktion wurde schon 1999 von Stahl et al. gezeigt) und über den C-Terminus mit SGT. Die Interaktion zwischen SGT und Hsc70 stabilisiert den trimeren Komplex mit CSP (Tobaben et al., 2001).

Hinweise darauf, dass SGT eine wichtige Rolle bei Prozessen in neuronalen Synapsen spielt, lieferten auch Experimente mit ausdifferenzierten Neuronen. Western Blot-Analysen mit Pro-teinextrakten aus nicht ausdifferenzierten neuronalen Zellen (NT2) und aus ausdifferenzierten Neuronen (NT2N) zeigten, dass SGT in NT2N-Zellen ein spezifisches Laufverhalten in der SDS-PAGE aufweist während in NT2-Zellen SGT jenes Laufverhalten zeigte, das auch in an-deren Geweben und Zellinien nachweisbar war. Außerdem akkumuliert SGT in NT2N-Zellen

Einleitung 23 sowohl im Kern als auch in den Synapsen. In NT2-Zellen hingegen zeigt SGT nukleäre und

zytoplasmatische Lokalisation (C. Cziepluch, persönliche Mitteilung).

SGT aus mitotischen Zellen zeigt ebenfalls ein verändertes Laufverhalten in der SDS-PAGE, wobei sich das M-Phase-Muster von dem aus ausdifferenzierten Neuronen unterscheidet. Es kann vermutet werden, dass SGT eine Aufgabe in der Mitose übernimmt, die aber bislang noch nicht bekannt ist (C. Cziepluch, persönliche Mitteilung). In Metaphase-Zellen ist SGT an den Spindelpolen lokalisiert, in Zellen, die sich in den späteren Stadien der Mitose befinden, akkumuliert es in der Mittelregion und im Mittelkörper. Das lässt auf eine mögliche Funktion von SGT bei der Cytokinese schließen (Winnefeld, Dipl., 2002). Die Aufklärung der Rolle von SGT in der Mitose/Cytokinese ist Gegenstand der Forschung in unserer Arbeitsgruppe.

Zielsetzung 24

2 Zielsetzung

NS1 ist das wichtigste regulatorische Protein des autonomen Parvovirus H1. Es ist essentiell für die virale DNA-Replikation, die Transaktivierung homologer und heterologer Promotoren sowie für den zytotoxischen Effekt des Virus in transformierten Zellinien. Als in vitro Interak-tionspartner von NS1 wurde das zelluläre Protein SGT identifiziert. SGT akkumuliert nach H1-Infektion in den APAR-Bodies, den Orten der parvoviralen Replikation, und wird in An-wesenheit von NS1 posttranslationell modifiziert. Aus diesen Gründen kann man annehmen, dass SGT möglicherweise an viralen replikativen oder regulatorischen Prozessen beteiligt ist.

In der hier vorgelegten Arbeit wurde die Aufklärung der Funktion des zellulären SGT-Proteins im parvoviralen Infektionszyklus angestrebt. Zunächst sollten Bereiche/Domänen im SGT-Protein identifiziert werden, die die Akkumulation dieses Proteins in APAR-bodies vermitteln. Es galt zu klären, ob die Interaktion mit NS1 notwendig und ausreichend für die Lokalisation von SGT in APAR-Bodies ist. Falls hingegen weitere zelluläre Faktoren hier ei-ne Rolle überei-nehmen, sollten diese Proteiei-ne mittels klassischer Ko-Immunpräzipitations-experimente identifiziert werden. Von Interesse war außerdem, die NS1-induzierte Modifika-tion näher zu charakterisieren, und zu ermitteln, ob sie für die korrekte LokalisaModifika-tion von SGT und für die SGT/NS1-Interaktion von Bedeutung ist.

Um Prozesse im Infektionszyklus des Parvovirus H1 zu identifizieren, an denen SGT funktio-nell beteiligt sein könnte, sollten zwei alternative experimentelle Ansätze verfolgt werden.

Der erste Ansatz bestand darin, den Einfluss der Überexpression von SGT oder verkürzter SGT-Proteine auf die virale Replikation und virale Proteinexpression zu untersuchen. Im zweiten Ansatz sollte der Einfluss einer drastisch verringerten SGT-Proteinmenge mittels RNAi-Technik (RNA interference-Technik) auf den parvoviralen Infektionszyklus untersucht werden.

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