4.1 Domänenstruktur von SGT
4.1.1 Die TPR-Domäne und der C-Terminus von SGT werden für die Loka- Loka-lisation in APAR-Bodies benötigt
Durch indirekte Immunfluoreszenzexperimente einerseits und Western Blot-Analysen zytoplasmatischer und nukleärer Proteinextrakte andererseits, wurde gezeigt, dass SGT gleichmäßig im Kern und im Zytoplasma lokalisiert ist (Cziepluch et al. 1998; Kordes, Diss., 1997). Nach H1-Infektion akkumuliert SGT mit NS1 und andere zelluläre Faktoren, wie Polα/δ, RPA, PCNA und Cyclin A, in APAR-Bodies (Cziepluch et al., 2000; Bashir et al., 2001). Bislang ist für SGT noch kein Kernlokalisationssignal identifiziert worden. Hier sollte versucht werden, die SGT-Region zu bestimmen, die für die Kernlokalisation und/oder die Akkumulation von SGT in den APAR-Bodies verantwortlich ist.
Zunächst wurde die Verteilung der verkürzten SGT-Proteine, FlagN-TPR und FlagTPR-C in der Zelle untersucht und ihre Lokalisation mit der des endogenen SGT-Proteins verglichen.
Parallel dazu wurde die zelluläre Lokalisation von FlagSGT untersucht, um sicher zu stellen, dass der Flagtag per se keinen Einfluss auf die zelluläre Verteilung der SGT-Fragmente hat.
Zu diesem Zweck wurden NBE-Zellen auf Deckgläschen kultiviert und mittels CaPO4
-Ergebnisse 61
SGT N-TPR TPR-C
SGT N-TPR TPR-C
Methode mit den Vektoren pXFlag-SGT, pXFlag-N-TPR oder pXFlagTPR-C transfiziert. 24h später wurden die Zellen fixiert, mit Flag-spezifischen Antikörpern inkubiert und mittels kon-fokaler Immunfluoreszenz-Mikroskopie analysiert.
Abb. 4-3: Subzelluläre Lokalisation von Flag-SGT und Flag-N-TPR und Flag-TPR-C in nicht infizierten NBE-Zellen mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie. 1x106 NBE-Zellen wurden auf Deckplättchen kultiviert und mit 10 JS;)ODJ6*76*7S;)ODJ1-TPR (N-TPR) oder pXFlagTPR-C (TPR-C) transfiziert. 24h später wurden die Zellen mit 1% Formalin fixiert und die Lokalisation der exprimierten Proteine durch konfokale Fluo-reszenz-Mikroskopie (LSM510 UV, Carl Zeiss, Jena) analysiert. Für die Detektion der Flag-Fusionsproteine wurde als Erstantikörper der monoklonale Flag-spezifische Ak M2 (1:4000) und als Zweitantikörper ein TRITC-JHNRSSHOWHU=LHJH -Maus-Antikörper (1:100, rote Fluoreszenz) verwendet.
Wie in der Abb. 4-3 zu erkennen ist, zeigte FlagSGT die selbe subzelluläre Verteilung wie das endogene SGT. Es war gleichmäßig im Kern und im Zytoplasma lokalisiert. Dieses Er-gebnis zeigte, dass Flagtag keinen Einfluss auf die zelluläre Lokalisation von SGT hat und deswegen als Fusionsanteil geeignet ist, um die Lokalisationsstudien durchzuführen. Auch FlagN-TPR und FlagTPR-C waren mit geringen Unterschieden sowohl im Kern als auch im Zytoplasma zu finden. N-TPR kam verstärkt zytoplasmatisch vor, während TPR-C eine über-wiegend nukleäre Lokalisation zeigte. FlagN-TPR könnte eine Sequenz enthalten, die eine größere Affinität zu zytoplasmatischen Komponenten zeigt, während Sequenzen im C-Terminus für die nukleäre Verteilung/Transport verantwortlich sein könnten. Da aber die N-TPR- wie auch die N-TPR-C-Mutante ein sehr kleines Molekulargewicht haben und in beiden Kompartimenten detektiert werden konnten, ist eine Diffusion der Proteinfragmente nicht auszuschließen.
Interessant war es nun herauszufinden, ob beide Mutanten bei Infektion mit H1-Virus im Nu-kleus vorkommen und genauer, ob sie in den APAR-Bodies akkumulieren. Zu diesem Zweck wurden die mit den Flag-Plasmiden transfizierten Zellen zusätzlich mit H1-Virus infiziert.
Anschließend wurden die Zellen fixiert und mit Flag- bzw. mit NS1-spezifischen Antikörpern
Ergebnisse 62 inkubiert. Bei der Immunfluoreszenz-Mikroskopie diente das NS1-Protein als Marker für die
Orte der parvoviralen Replikation.
Abb. 4-4: Subzelluläre Lokalisation von FlagSGT und FlagN-TPR und FlagTPR-C in H1 infizierten NBE-Zellen mittels konfokaler Immunfluoreszenz-Mikroskopie. 1x106 NBE-Zellen wurden auf Deckplättchen kul-WLYLHUWXQGPLW JS;)ODJ6*7S;)ODJ1-TPR oder pXFlagTPR-C transfiziert. 24h später wurden die Zellen mit H1 (MOI = 10) infiziert und 24h nach Infektion mit 1% Formalin fixiert. Als Erstantikörper wurde für die Detektion von NS1 der polyklonale Sp8-Ak (1:1000; b, e und h) und für FlagSGT (a), FlagN-TPR (d) und FlagTPR-C (g) der monoklonale Flag-spezifische Ak M2 (1:4000) verwendet. Als Zweitantikörper wurde für NS1 ein FITC-JHNRSSHOWHU=LHJH -Kaninchen-Antikörper (1:100, grüne Fluoreszenz) und für die Flag-Proteine ein TRITC-JHNRSSHOWHU=LHJH -Maus-Antikörper (1:100, rote Fluoreszenz) verwendet. Nach Überlappung der beiden Kanäle (merge; c, f und i) zeigt die gelbe Farbe die Kolokalisation von NS1 mit FlagSGT (c) und FlagTPR-C (i). FlagN-TPR lokalisiert nicht in den APAR-Bodies (f)
In der Abb. 4-4 belegt die gelbe Farbe im merge (c) eindeutig, dass NS1 (b) mit FlagSGT (a) in den punktartig verteilten APAR-Bodies im Zellkern kolokalisierte, d.h., dass auch hier der Flagtag die Lokalisation von SGT nicht beeinflusste. Eine Akkumulation in den APAR-Bodies war auch bei FlagTPR-C (i) zu beobachten. FlagN-TPR kolokalisierte dagegen nicht mit NS1 in den parvoviralen Replikationsorten (f) und zeigte eine ähnliche Verteilung wie in nicht infizierten Zellen (Vergleich Abb. 4-3 N-TPR und Abb. 4-4d).
FlagTPR-C FlagN-TPR
FlagSGT
a b c
d
h e
g i
f
a-Flag a-NS1 merge
-Flag -NS1 merge
Ergebnisse 63 Diese Beobachtungen konnten durch Immunfluoreszenzexperimente mit SGT bzw.
SGT-Subfragmenten bestätigt werden, die als VP22-Fusionsproteine überexprimiert wurden (Abb.
4-5). Diese Fusionsproteine enthalten das Strukturprotein des HSV-1 (herpes simplex virus-1), VP22, als Fusionsanteil an ihrem N-Terminus. An ihrem C-Terminus befindet sich ein myc-Epitop sowie ein Histag. Für die Expression der Proteine wurde die DNA über PCR amplifi-ziert und über TOPO-Klonierung mit dem linearen pVP22/myc-His-TOPO-Vektor (Invitro-gen) ligiert. Bei den Immunfluoreszenzen wurden die Proteine mit Hilfe eines myc-spezifischen Antikörpers sichtbar gemacht.
In Abb. 4-5 ist deutlich zu erkennen, dass wie bei den Flag-Fusionsproteinen VP-SGT (a-c) und VP-TPR-C (g-i) in APAR-Bodies akkumulierten, während VP-N-TPR (d-f) nicht in die-sen parvoviralen Replikationsorten lokalisierte. Das VP22-Protein, das hier als Kontrolle diente, lokalisierte unabhängig von einer Infektion im Nukleus (Elliott & O´Hare, 1997), ko-lokalisierte aber nicht mit NS1 in den APAR-Bodies (j-l).
Es wurden auch N- und C-terminale GFP-Fusionsproteine sowie C-terminale Dsred2-Fusionsproteine konstruiert. Die SGT-Fragmente wurden über PCR amplifiziert und in pGFP-C1-, pGFP-N1 und pDsred2-N1-Vektor über die Restriktionsschnittstellen EcoRI/BamHI reinkloniert. Sowohl bei den N- als auch bei den C-terminalen Konstrukten konnte keine sta-bile Expression der GFP-Fusionsproteine beobachtet werden. Es liegt wahrscheinlich daran, dass bei diesen Konstrukten der GFP- oder der SGT-Anteil nicht die richtige Konformation einnehmen konnten. Im Gegensatz dazu konnten die SGT-Fragmente als C-terminale Dsred2-Fusionsproteine überexprimiert werden. Als Dsred2-Dsred2-Fusionsproteine zeigten SGT und TPR-C in nicht infizierten Zellen eine ähnliche Lokalisation wie die Flag- und VP22-Fusionsproteine.
Dsred2-N-TPR bildete dagegen große Aggregate im Cytoplasma (Daten nicht gezeigt). Seine Expression wie auch die Expression von SGT-Dsred2 schien sehr toxisch für die Zelle zu sein.
Da TPR-C in den APAR-Bodies akkumulierte, sollte auch geklärt werden, ob der C-Terminus oder die TPR-Domäne allein ausreichend für die Lokalisation von SGT in den APAR-Bodies ist. Dafür wurden die TPR-Domäne und der C-Terminus als Flag-Fusionsproteine exprimiert und ihre subzelluläre Lokalisation in infizierten und nicht infizierten Zellen untersucht. So-wohl in infizierten als auch in nicht infizierten Zellen konnten FlagTPR und FlagC im Nu-kleus und im Zytoplasma nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Eine Infektion hatte
Ergebnisse 64 keinen Einfluss auf ihre subzelluläre Lokalisation. Bei der Verteilung dieser kleinen
Frag-mente könnte auch eine passive Diffusion in Frage kommen.
Abb. 4-5: Subzelluläre Lokalisation von VP22, VP-SGT, VP-N-TPR und VP-TPR-C in H1 infizierten NBE-Zellen mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie. 1x106 NBE-Zellen wurden mit 10 JS93-SGT, pVP-N-TPR oder pVP-pVP-N-TPR-C transfiziert. 24h später wurden die Zellen mit H1 (MOI = 10) infiziert und 24h nach In-fektion mit 1% Formalin fixiert Als Erstantikörper wurde für die Detektion von NS1 der polyklonale Antikörper Sp8 (1:1000; b, e, h und k) und für VP-SGT(a) und VP-SGT-Subfragmente (VP-N-TPR: d; VP-TPR-C: g und VP22: j), ein monoklonaler myc-spezifischer Antikörper (Invitrogen; 1:500) verwendet. Als Zweitantikörper wurde für NS1 der FITC-JHNRSSHOWH=LHJH -Kaninchen-Antikörper (1:100, grüne Fluoreszenz) und für die VP-Proteine der TRITC-JHNRSSHOWH=LHJH -Maus-Antikörper (1:100, rote Fluoreszenz) verwendet. Die Überlappung der beiden Kanäle (merge; c, f, i, l) zeigt die Kolokalisation von SGT(c) und TPR-C(i) mit NS1 in den APAR-Bodies. N-TPR(f) oder VP22(l) akkumulieren nicht in den parvoviralen Replikationsorten.
VP-SGT
Ergebnisse 65 Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass die TPR-Domäne und die C-terminale
Do-mäne von SGT ausreichend sind für die korrekte Lokalisation von SGT in APAR-Bodies infi-zierter Zellen. Die N-terminale Domäne leistet offensichtlich keinen Beitrag zu dieser Posi-tionierung von SGT.