pV3SDlacZ und pV3lacZ

Für die Untersuchung von Promotoraktivitäten in B licheniformis wurden auf Grundlage des pV2-Shuttle-Vektors die Reportervektoren pV3SDlacZ und pV3lacZ hergestellt. Hierfür wurden die Reporterkassetten aus pAC6 und pAC7 verwendet. pAC6 und pAC7 nutzen das lacZ-Gen der ß-Galaktosidase aus E. coli als Reportergen zur Messung von Transkriptions- und Translationsaktivitäten. Der entscheidende Unterschied zwischen den beiden Vektoren liegt im 5' Bereich des lacZ Gens. Die Reporterkassette des pAC6 hat eine Ribosomenbindestelle (RBS) vor dem lacZ. Der zu untersuchende Promotor kann in die vor dem lacZ liegende Multi Cloning Site (MCS) kloniert werden und benötigt keine native RBS. Hierbei wird die gemessene ß-Galaktosidaseaktivität mit der Promotoraktivität korreliert.

Auf diese Art kann auch die transkriptionelle Aktivität von Promotoren untersucht

Reporterkassette des pAC7 besitzt keine RBS. Hier muss der Promotor von Interesse mit den ersten Triplets des dahinter liegenden Gens, also inklusive der nativen RBS, an das lacZ fusioniert werden. Mit so einem Konstrukt wird die native Genexpression eines proteinkodierenden Gens mittels ß-Galaktosidaseaktivität ermittelt.

Diese beiden etablierten Systeme wurden für die Arbeit in B. licheniformis DSM13 nutzbar gemacht indem die Reporterkassetten aus pAC6 bzw. pAC7 mit dem pV2 Vektor kombiniert wurden. Zunächst wurde mit den Oligonukleotidpaar HLRH120/121 die Reporterkassette aus dem pAC6 amplifiziert (siehe Kapitel 2.4.1.5), wobei mittels Oligonukleotidüberhängen an beiden Seiten die AscI-Erkennungssequenz angefügt wurde und zusätzlich vor das lacZ-Gen eine neue MCS angebracht wurde. Das PCR-Produkt wurde mit AscI und der pV2-Vektor mit AscI und MluI verdaut (siehe Kapitel 2.4.1.9). Durch Ligation des linealisierten Vektors mit dem PCR-Produkt und Klonierung in E. coli (siehe Kapitel 2.4.2.2) wurde der Vektor pV3SDlacZ hergestellt und mittels Sequenzierung (siehe Kapitel 2.4.6) verifiziert. Dieser trägt die Reporterkassetten von pAC6 und kann zur Messung von Transkriptionsaktivitäten von Promotoren in B. licheniformis eingesetzt werden (siehe Abbildung 15). Zur Herstellung eines Reportervektors ohne artifizielle RBS, also ein Äquivalent zu pAC7, wurde im pV3SDlacZ und pAC7 die 5' Region der Reporterkassetten mit den Endonukleasen SmaI und SacI ausgeschnitten (siehe Kapitel 2.4.1.9). Mittels Gelextraktion wurde das Vektorrückrad des pV3SDlacZ und das Fragment der Reporterkassette aus pAC7 aufgereinigt (siehe Kapitel 2.4.1.8), miteinander legiert (siehe Kapitel 2.4.1.10) und kloniert (siehe Kapitel 2.4.2.2). Der hergestellte Vektor pV3lacZ wurde mittels Sequenzierung verifiziert (siehe Kapitel 2.4.6). Dieser trägt die lacZ-Reporterkassette des pAC7 Vektors zur gekoppelten Messung von Transkriptions- und Translationsaktivitäten.

pV3SDlacZ (auch in E. coli aktiv)

oriT (RP4) aus pKVM1 für konjugative für E. coli aus pSG1151 (~200 Kopien)

Abbildung 15: Vektorkarte des pV3SDlacZ-Vektors

Beim pV3SDlacZ-Vektor handelt es sich um einen konjugativ übertragbaren E. coli / Bacillus-Shuttle-Reportervektor. Dieser ist modular aufgebaut. Die einzelnen Elemente sind in der Darstellung mit unterschiedlichen Farben unterlegt. Beschreibungen der einzelnen Elemente sind in der Grafik abgebildet und mit der dazugehörigen Farbe markiert. Die Reporterkassette des pAC6-Vektors trägt ein E. coli-lacZ-Gen. Die Aktivität eines vor die Reporterkassette klonierten Elements kann mittels der ß-Galaktosidaseaktivität ermittelt werden. Der pV3SDlacZ-Vektor basiert auf dem pV2-Vektor (siehe Abbildung 12). Der Vektor pV3lacZ unterscheidet sich vom dargestellten pV3SDlacZ durch das Fehlen der artifiziellen RBS vor dem lacZ-Gen.

3.2.2.1 Promotoranalysen mittels pV3SDlacZ

Viele RNA-Moleküle wie sRNAs oder antisense-RNAs kodieren keine Proteine.

Demnach haben diese RNA-Moleküle keine natürliche RBS. Um die Promotoraktivität und Regulation solcher Elemente untersuchen zu können, kann der Reportervektor pV3SDlacZ mit artifizieller Ribosomenbindestelle verwendet werden. Der Vektor eignet sich auch für die Untersuchung von Promotoren proteinkodierender Gene auf transkriptioneller Ebene. Um die Funktionalität von pV3SDlacZ zu überprüfen wurden die Promotoren eines proteinkodierenden Gens (BLi_05060) sowie einer antisense-RNA (BLi_r1585) verwendet (siehe Abbildung 17).

Zur Amplifizierung des Promotorbereichs von BLi_05060 wurde das Oligonukleotidpaar HLRH78/79 benutzt, wobei die Schnittstellen XhoI und EcoRI an das PCR-Fragment fusioniert wurden (siehe Kapitel 2.4.1.5). Unter

Verwendung der angehängten Restriktionsschnittstellen wurde der Promotorbereich in den Vektor pV3SDlacZ kloniert (siehe Kapitel 2.4.2.2) und ergab den pV3SDlacZ_PBLi_05060, welcher konjugativ in B. licheniformis DSM13 übertragen wurde (siehe Kapitel 2.4.2.5) und damit den Stamm B. licheniformis DSM13 pV3SDlacZ_ PBLi_05060 ergab.

Zur Amplifizierung des Promotorbereichs der BLi_r1585 antisense-RNA wurde das Oligonukleotidpaar HLRH80/81 benutzt, wobei die Schnittstellen XhoI und EcoRI an das PCR-Fragment fusioniert wurden (siehe Kapitel 2.4.1.5). Unter Verwendung der angehängten Restriktionsschnittstellen wurde der Promotorbereich in den Vektor pV3SDlacZ kloniert (siehe Kapitel 2.4.2.2) und ergab den pV3SDlacZ_PBLi_r1585, welcher konjugativ in B. licheniformis DSM13 übertragen wurde (siehe Kapitel 2.4.2.5) und damit den Stamm B. licheniformis DSM13 pV3SDlacZ_ P_{BLi_r1585} ergab.

A

B

Abbildung 16: Transkriptionsprofil von BLi_05060 und BLi_r1585

Die Abbildung zeigt das mit TraV visualisierte Transkriptom von B. licheniformis DSM13 unter industriellen Produktionsbedingungen. Zur Verdeutlichung der Signale wurden die Sequenzen aus mehreren Replikaten vereinigt dargestellt. Die schwarzen Pfeile stellen proteinkodierende Bereiche im Genom dar. Der rote Graph symbolisiert die experimentell ermittelte transkriptionelle Aktivität auf dem Plusstrang und der blaue auf dem Minusstrang. Die grünen Pfeile markieren die Oligonukleotide mit denen die Promotorregionen amplifiziert wurden. A: Transkriptionelle Aktivität von BLi_05060 (rot). B: Transkriptionelle Aktivität von BLi_r1585 (rot). In beiden Fällen ist transkriptionelle Aktivität eindeutig zu erkennen.

Die erstellten Stämme wurden für eine β-Galaktosidase-Messung (siehe Kapitel 2.4.3.1) benutzt. Als Kontrolle diente der Wildtypstamm B. licheniformis DSM13 und der mit dem Leervektor transformierte Stamm B. licheniformis DSM13 pV3SDlacZ. Die Kulturen wurden bei 37 °C angezogen. Die Ergebnisse der β-Galaktosidase-Messungen sind in Abbildung 17 dargestellt und die zugrundeliegenden Messergebnisse in Tabelle 18 im Anhang zu finden. Das Reportersystem pV3SDlacZ ist funktionell. Die Aktivität im Wildtypstamm bzw.

die durch den Leervektor pV3SDlacZ generierte β-Galaktosidase Grundaktivität liegen über den gesamten Messzeitraum bei maximal 40 Miller Units. Der Vektor mit dem Promotor des proteinkodierenden Gens BLi_05060 zeigt eine kontinuierliche Zunahme der β-Galaktosidase-Aktivität von etwa 90 Miller Units nach 4 h Wachstum bis etwa 660 Miller Units nach 10 h Wachstum. Der Vektor mit dem Promotor des BLi_r1585 antisense-RNA-Gens zeigt keine kontinuierliche Zunahme der β-Galaktosidase-Aktivität. Hier ist nach 4 h mit etwa 200 Miller Units eine deutlich höhere β-Galaktosidase-Aktivität als beim BLi_05060 Promotorkonstrukt zu beobachten, doch wurde hier der Höhepunkt bereits nach 6 h mit etwa 430 Miller Units erreicht und reduzierte sich nach 10 h auf etwa 325 Miller Units.

Zeit in Stunden

M il le r U n it s

4 6 8 10

0 100 200 300 400 500 600

700

DSM13

pV3SDlacZ P

P

BLi_05060 BLi_r1585

Abbildung 17: β-Galaktosidase-Aktivität der Promotoren von BLi_05060 und BLi_r1585 im pV3SDlacZ Reportersystem

Die β-Galaktosidase-Aktivität wurde ermittelt wie in Kapitel 2.4.3.1 beschrieben und ist in Miller Units dargestellt. Die Probennahme erfolgte nach 4, 6, 8, und 10 h. Die Stämme DSM13 = B. licheniformis DSM13, pV3SDlacZ = B. licheniformis DSM13 pV3SDlacZ, P_{BLi_05060} = B. licheniformis DSM13 pV3SDlacZ_P_{BLi_05060}, P_{BLi_r1585} = B. licheniformis DSM13 pV3SDlacZ_P_{BLi_r1585} wurden untersucht. Der Grafik zugrunde liegende β-Galaktosidase-Aktivitätswerte sind in Tabelle 18 im Anhang zu finden.

3.2.2.2 Promotoranalysen mittels pV3lacZ

Das Reportersystem pV3lacZ ist für Promotoruntersuchungen geeignet bei denen die native Ribosomenbindestelle des zu untersuchenden Gens berücksichtigt werden soll. Hierfür wird die Promotorregion inklusive der ersten kodierenden Triplets im Leseraster an das lacZ-Gen fusioniert. Damit reflektiert die β-Galaktosidase-Aktivität die gesamte Expressionsaktivität des betrachteten Promotors.

Der pV3lacZ Vektor wurde am Beispiel des narGHIJ-Promotors aus B. licheniformis DSM13, welcher für eine Nitratreduktase kodiert und in B. subtilis 168 nachweislich unter anaeroben Bedingungen exprimiert wird [158], auf seine Funktionalität überprüft. Dafür wurde mit dem Oligonukleotidpaar HLRH208/209 der narGHIJ-Promotor aus chromosomaler DNA von B. licheniformis DSM13 amplifiziert (siehe Kapitel 2.4.1.5). Hierbei wurden mittels Oligonukleotidüberhängen die XhoI- und SmaI-Schnittstellen an das PCR-Produkt angehängt. Diese wurden benutzt um den narGHIJ-Promotor in den pV3lacZ-Vektor zu kloniert (siehe Kapitel 2.4.2.2), wobei pV3lacZ_P_narG

entstand. Der so erstellte Vektor wurde konjugativ auf B. licheniformis MW3 übertragen (siehe Kapitel 2.4.2.5), wobei der Stamm B. licheniformis MW3 pV3lacZ_PnarG entstand. Gleichsam wurde mit dem Leervektor verfahren.

Die resultierenden Stämme wurden nach Shariat et al., 1995 [109] im Minimalmedium für Bacillus (siehe Kapitel 2.3.4.5) aerob mit Glukose und anaerob mit Glukose und Nitrat angezogen und nach definierten Zeitabständen die Aktivität der ß-Galaktosidase ermittelt.

Unter aeroben Bedingungen war die β-Galaktosidase-Aktivität für B. licheniformis MW3 pV3lacZ_PnarG nicht entscheidend erhöht im Vergleich zu den Negativkontrollen. Die Messwerte sind in Tabelle 19 im Anhang aufgeführt.

Unter anaeroben Bedingungen war im Vergleich zu den Kontrollstämmen (B. licheniformis MW3 und MW3 pV3lacZ) eine stark erhöhte β-Galaktosidase-Aktivität für B. licheniformis MW3 pV3lacZ_P_narG nachweisbar (siehe Abbildung 19 und Tabelle 20). Bereits nach 2,5 h hat dieser 300 Miller Units überschritten, wobei nach 5 h mehr als 1000 und 7,5 h über 1 mio Miller Units gemessen wurden. B. licheniformis MW3 und MW3 pV3lacZ wiesen beide eine miteinander vergleichbare Grundaktivität von maximal 5 Miller Units über die gesamte Messdauer auf. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass der Leervektor kaum β-Galaktosidase-Aktivität generiert, der narGHIJ Promotor nur unter anaeroben Bedingungen exprimiert wird und dass der pV3lacZ Vektor funktioniert. Somit konnte das pV3-lacZ-System unter aeroben und anaeroben Bedingungen erfolgreich eingesetzt werden.

Zeit in Studen

M il le r U n it s

2.5 5

7.5 10

0 100 200 300 400 500 600 700

1000 überschritten 1 mio. überschritten 1 mio. überschritten

MW3

pV3lacZ P

Abbildung 18: β-Galaktosidase-Aktivität des narGHIJ-Promotors im pV3lacZ Reportersystem unter anaeroben Bedingungen

Die β-Galaktosidase-Aktivität wurde ermittelt wie im Kapitel 2.4.3.1 beschrieben und ist in Miller Units dargestellt. Die Probennahme erfolgte nach 2.5, 5, 7.5, und 10 h. Die Stämme MW3

= B. licheniformis MW3, pV3lacZ = B. licheniformis MW3 pV3lacZ, P_narGHIJ = B. licheniformis MW3 pV3lacZ_PnarGHIJ wurden untersucht. Die zugrunde liegenden Messwerte sind in Tabelle 20 im Anhang zu finden.