pV3Xg

Der Vektor pV3Xg wurde für die Analyse von cis-regulatorischen RNA-Elementen in B. licheniformis konzipiert. Der Vektor basiert auf dem pV2-Vektor.

Bei der Konstruktion von pV3Xg wurde auf die ligasefreie Erstellung von DNA-Konstrukten zurückgegriffen (Kapitel 2.4.1.11). Hierbei wurde mit den Oligonukleotiden HLRH35/37 (großes Fragment) und HLRH36/38 (kleines Fragment) der pV2-Vektor amplifiziert. Mit den Oligonukleotiden HLRH39/41 (großes Fragment) und HLRH40/42 (kleines Fragment) wurde das xylR-Gen und der xylAB-Promotor aus B. megaterium PV311 amplifiziert. Mit den Oligonukleotiden HLRH43/45 (großes Fragment) und HLRH44/46 (kleines Fragment) wurde das gfp-Gen aus pSG1151 amplifiziert. Alle drei Fragmente besaßen zu einander kompatible Überhänge und wurden in einer einzelnen Renaturierungsreaktion zu einem zirkulären Vektor zusammen gefügt und anschließend in E. coli transformiert (siehe Kapitel 2.4.2.2). In diesem Prozess

entstand nicht nur der pV3Xg sondern auch die in diesem Vektor verwendete Reporterkassette (siehe Abbildung 19). Diese besteht aus dem Reportergen gfp, vor dem der xylAB-Promotor aus B. megaterium PV311 liegt, und dem zum Promotor dazugehörenden Repressorgen xylR. Das Vorliegen des xylR-Gens auf dem Vektor soll dafür sorgen, dass der daraus resultierende Xyloserepressor XylR in ausreichender Menge in der Zelle vorliegt und die Reprimierung des Xylosepromotors gewährleistet. Dieser Vektor wurde mittels Sequenzierung verifiziert und konnte aus E. coli und aus B. licheniformis MW3 erfolgreich re-isoliert werden.

Für die Untersuchung von cis-regulatorischen RNA-Elementen sollte das zu untersuchende RNA-Element mit den ersten proteinkodierenden Triplets des darauf folgenden Gens im Leseraster an das gfp Gen fusioniert werden, da dieses über keine artifizielle RBS verfügt. Dabei ist darauf zu achten, dass der natürliche Promotor der cis-regulatorischen RNA nicht mit kloniert wird, um sicherzustellen, dass diese nur durch den Xylose-induzierbaren Promotor exprimiert werden kann.

pV3Xg (auch in E. coli aktiv)

oriT (RP4) aus pKVM1 für konjugative pSG1151 mit PxylABund xylR aus B. megateriumPV311

Replikationskassette für E. coli aus pSG1151 (~200 Kopien)

Abbildung 19: Vektorkarte des pV3Xg-Vektors

Beim pV3Xg-Vektor handel es sich um einen konjugativ übertragbaren E. coli / Bacillus-Shuttle-Reportervektor. Dieser ist modular aufgebaut. Die einzelnen Elemente sind in der Darstellung mit unterschiedlichen Farben unterlegt. Beschreibungen der einzelnen Elemente sind in der Grafik abgebildet und mit der dazugehörigen Farbe markiert. Die mit dem Vektor neu erstellte Reporterkassette trägt das gfpmut1-Gen (gfp) aus dem pSG1151-Vektor und den Xylose-induzierbaren PxylAB-Promotor aus B. megaterium PV311. Die Aktivität eines vor die Reporterkassette klonierten Elements kann über die GFP-Fluoreszenz verfolgt werden. Der pV3Xg-Vektor basiert auf dem pV2-Vektor (siehe Abbildung 12).

3.2.3.1 Untersuchung des pbuG-Riboswitch im pV3Xg-Reportersystem Der gfp-Reportervektor pV3Xg wurde am Beispiel des pbuG-Riboswitches aus B. licheniformis DSM13, der bereits in der Diplomarbeit von Christel Gaubitz experimentell untersucht wurde [159], getestet. Hierfür wurde der pbuG-Riboswitch mit den Oligonukleotiden HLRH83/84 aus dem Genom von B. licheniformis DSM13 amplifiziert und mittels der Restriktionsschnittstellen NheI und XhoI in den Vektor pV3Xg kloniert (siehe Kapitel 2.4.2.2). Der so entstandene pV3Xg_RSpbuG und der entsprechende Leervektor wurden konjugativ in B. licheniformis MW3 übertragen, und so die Stämme B. licheniformis MW3 pV3Xg und B. licheniformis MW3 pV3Xg_RSpbuG generiert. Zur Untersuchung der Funktionalität des pV3Xg-Vektors wurden die Stämme B. licheniformis MW3, MW3 pV3Xg und MW3 pV3Xg_RS_pbuG in LB-Medium (siehe Kapitel 2.3.4.2) als Vorkultur angezogen, mit dieser Vorkultur die Hauptkultur in

Mineralmedium (siehe Kapitel 2.3.4.4) auf eine OD₆₀₀ 0,1 angeimpft und jeweils mit Glukose, mit Xylose, mit Glukose plus Guanosin und mit Xylose plus Guanosin angezogen und mikroskopiert. Glukose reprimiert und Xylose induziert den Xylosepromotors [160]. Die Abwesenheit von Guanosin aktiviert den pbuG-Riboswitch, so dass das dahinterliegende Gen transkribiert werden kann. Im Fall des pV3Xg_RSpbuG -Konstrukts wird das gfp-Gen exprimiert. Die Anwesenheit von Guanosin sollte den pbuG-Riboswitch deaktivieren und das gfp-Gen dürfte nicht exprimiert werden [159, 161].

Die Ergebnisse der GFP-Mikroskopie sind in Tabelle 9 dargestellt. Für B. licheniformis MW3 und B. licheniformis MW3 pV3Xg konnte unter keinen Anzuchtbedingungen eine GFP-Fluoreszenz beobachtet werden. Beim Stamm B. licheniformis MW3 pV3Xg_RSpbuG konnte im Glukose-supplementierten Medium (Xylosepromotor reprimiert) nur vereinzelt Fluoreszenz beobachtet werden, im Xylose-supplementierten Medium (Xylosepromotor induziert) konnte eine starke Fluoreszenz beobachtet werden (siehe Abbildung 20), im Glukose- und Guanosin-supplementierten Medium (Xylosepromotor reprimiert, pbuG-Riboswitch aus) konnte keine Fluoreszenz beobachtet werden und im Xylose- und Guanosin-supplementierten Medium (Xylosepromotor induziert, pbuG-Riboswitch aus) konnte nur vereinzelt Fluoreszenz beobachtet werden. Der Vektor pV3Xg war somit funktionell und für die Untersuchung von einem cis-regulatorischen RNA-Element, dem pbuG-Riboswitch, geeignet.

Tabelle 9: Fluoreszenz-Mikroskopie-Ergebnisse von B. licheniformis MW3 pV3Xg_RS_pbuG

Stamm Medienzusatz GFP-Fluoreszenz

MW3 D-Glukose keine

MW3 D-Xylose keine

MW3 D-Glukose Guanosin keine

MW3 D-Xylose Guanosin keine

MW3 pV3Xg D-Glukose keine

MW3 pV3Xg D-Xylose keine

MW3 pV3Xg D-Glukose Guanosin keine

MW3 pV3Xg D-Xylose Guanosin keine

MW3 pV3Xg_RS_pbuG D-Glukose vereinzelt

MW3 pV3Xg_RS_pbuG D-Xylose starke Fluoreszenz

MW3 pV3Xg_RS_pbuG Glukose Guanosin keine Fluoreszenz

MW3 pV3Xg_RSpbuG Xylose Guanosin vereinzelt

Ebene 2

Transparenz 30%

Ebene 1

Abbildung 20: Fluoreszenz-Mikroskopie von B. licheniformis MW3 pV3Xg_RS_pbuG

A: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme. B: GFP-Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme. C:

Überlagerung der Ebene 1 (A) mit Ebene 2 (B) mit 30% Transparenz. Eine deutliche GFP-Fluoreszenz ist zu beobachten.