Genetischer Ursprung der isolierten Prophagen-DNA

Um den genetischen Ursprung der beobachteten Phagen-DNA (siehe Kapitel 3.1.6) zu identifizieren, wurde diese sequenziert und untersucht.

3.1.7.1 Phagen-DNA aus B. licheniformis DSM13 und MW3

Mit der Untersuchung der phagenpartikelgeschützten DNA (siehe Kapitel 3.1.6) ist festgestellt worden, dass die Prophagenpartikel von B. licheniformis DSM13 zwei unterschiedliche DNA-Fragmente freisetzen. Um den Ursprung dieser DNA im Genom von B. licheniformis DSM13 zu identifizieren, wurde die phagenpartikelgeschützte DNA mittels NGS-Technologie (siehe Kapitel 2.4.6) sequenziert. Die generierten Sequenzen wurden im Genom von B. licheniformis DSM13 kartiert (siehe Kapitel 2.7.1.1) und diese Zuordnung mit dem Programm TraV (siehe Kapitel 2.7.1) visualisiert. Anschließend wurden mit TraV NPKM-Werte für kontinuierliche 1 kb-Fragmente berechnet (siehe Kapitel 2.7.1.3) und grafisch dargestellt (Abbildung 9).

Abbildung 9: Sequenzverteilung der Phagen-DNA aus B. licheniformis DSM13 und MW3 Aufgetragen sind NPKM-Werte generiert mit TraV in kontinuierlichen 1 kb-Fragmenten aus den Sequenzzuordnungen der Phage-DNA, gewonnen aus B. licheniformis DSM13 (roter Graph) und MW3 (gelber Graph). Die Prophagenbereiche BLi_Pp1 bis BLi_Pp7 sind mit grauen Balken kenntlich gemacht. Die Sequenzverteilung beider Experimente ist vergleichbar. Im Bereich des chromosomalen Replikationsursprungs um 0 Mbp und 4 Mbp, ist eine Anhäufung der Sequenzen zu erkennen. Prophage BLi_Pp3 weist die höchste Sequenzanhäufung auf. Geringfügige Anhäufungen sind auch in den Prophagenbereichen BLi_Pp2, BLi_Pp6 und BLi_Pp7 zu beobachten.

In Abbildung 9 ist die Sequenzaufbereitung der Phagen-DNA für B. licheniformis DSM13 und MW3 zu sehen. Die Sequenzen der Phagen-DNA verteilen sich wannenförmig, fast gleichmäßig, auf dem Genom von B. licheniformis DSM13.

Das trifft sowohl für die Sequenzen der Phagen-DNA aus B. licheniformis DSM13 als auch auf MW3 zu. Um den Prophagenbereich BLi_Pp3 gibt es die stärkste Anhäufung von Sequenzen. Diese weist keine klare Abgrenzung auf, sondern läuft zu beiden Seiten aus. Weiterhin konnten leichte Sequenzanhäufungen an den Prophagenregionen BLi_Pp2, BLi_P6 und BLi_Pp7 beobachtet werden. In der Prophagenregion BLi_Pp7 gibt es bei der Sequenzzuordnung der B. licheniformis MW3 Phagen-DNA im Vergleich zu der Sequenzzuordnung der B. licheniformis DSM13 Phagen-DNA einen Einbruch.

Dieser ist auf die Deletion des RM-Systems in MW3 in dieser Region zurückzuführen. Alle weiteren Einbrüche in der Sequenzabdeckung sind bedingt durch das Zuordnungsverfahren. Bei diesem werden Sequenzen, die im Genom doppelt zugeordnet werden können, nicht berücksichtigt. Somit bleiben repetitive Sequenzbereiche frei von Sequenzabdeckung und führen zu den beobachteten Einbrüchen im Graph.

3.1.7.2 Phagen-DNA aus B. licheniformis ΔPBSX

Die im Kapitel 3.1.7.1 betrachteten Stämme B. licheniformis DSM13 und MW3 besitzen beide einen PBSX-ähnlichen Prophagen [51, 52], der im Genom als BLi_Pp2 annotiert (siehe Kapitel 3.1.1) und experimentell, mittels TEM (siehe Abbildung 7 A), untersucht wurde. Die Abhängigkeit der ~13 kb Bande von dem PBSX-ähnlichen Prophagen BLi_Pp2 ist im Kapitel 3.1.6 experimentell nachgewiesen. Nun sollte überprüft werden, ob die ~13 kb Phagen-DNA-Bande (siehe Abbildung 8) wie beim PBSX-Prophagen aus B. subtilis 168 [157]

hauptsächlich aus chromosomaler DNA besteht und zu der gleichmäßigen Sequenzverteilung der Phagen-DNA auf dem Genom von B. licheniformis DSM13 (siehe Kapitel 3.1.7.1) führte. Hierfür wurde Phagen-DNA aus B. licheniformis ΔPBSX (ΔBLi_Pp2) gewonnen (siehe Kapitel 3.1.6), NGS sequenziert (siehe Kapitel 2.4.6) und ausgewertet (siehe Kapitel 3.1.7.1). Das Ergebnis ist in Abbildung 10 dargestellt.

Abbildung 10: Sequenzverteilung der Phagen-DNA aus B. licheniformis ΔPBSX

Aufgetragen sind NPKM-Werte, generiert mit TraV, in kontinuierlichen 1 kb-Fragmenten auf der Sequenzzuordnung der Phagen-DNA, gewonnen aus B. licheniformis ΔPBSX. Die Prophagenbereiche BLi_Pp1 bis BLi_Pp7 sind mit grauen Balken kenntlich gemacht. Prophage BLi_Pp3 weist die höchste Sequenzanhäufung auf. Diese ist nach links scharf abgegrenzt und klingt nach recht, kontinuierlich über einen ~200 kb Bereich, aus. Eine geringere, nach beiden Seiten scharf abgegrenzte Sequenzanhäufung ist im Prophagenbereich BLi_Pp6 zu beobachten.

Es ist deutlich zu erkennen, dass es im Fall der Phagen-DNA aus B. licheniformis ΔPBSX keine gleichmäßige Verteilung der Sequenzen auf dem Chromosom von B. licheniformis DSM13 vorliegt. Die einzigen beiden beobachteten Sequenzakkumulationen sind über zwei Prophagenbereichen lokalisiert. Daraus wurde abgeleitet, dass die in diesem Stamm abwesende ~13 kb Phagen- DNA-Bande, wie bei B. subtilis 168 vom PBSX Prophagen eingepackte chromosomale DNA darstellt. Diese vom Prophagen BLi_Pp2 transportierte Phagen-DNA war somit der Grund für die gleichmäßige Sequenzverteilung im vorrangehenden Experiment, beschrieben im Kapitel 3.1.7.1.

Die stärkste Sequenzakkumulation war über dem Prophagen BLi_Pp3 zu beobachten. Diese Anhäufung ist nach links deutlich abgegrenzt und läuft nach rechts über eine Länge von 200 kb aus. Dieses Auslaufen der Sequenzakkumulation am Prophagen BLi_Pp3 deckt den benachbarten Prophagen BLi_Pp4 zusätzlich ab. Die zweite Sequenzakkumulation war über dem Prophagen BLi_Pp6 zu beobachten und war nur auf diesen konzentriert.

3.1.7.3 Phagen-DNA aus B. licheniformis ΔPBSX-ΔBLi_Pp3

Bei der Untersuchung der Phagenpartikel, gewonnen aus dem Stamm B. licheniformis ΔPBSX, war nur ein Typ von Siphoviridae-ähnlichen Phagenpartikeln beobachtet worden (siehe Abbildung 7 B). Auch die Betrachtung der Phagen-DNA im Agarosegel wies nur eine ~40 kb große DNA-Bande auf (siehe Abbildung 8). Die im Kapitel 3.1.7.2 beschriebene Untersuchung der NGS-sequenzierten Phagen-DNA aus B. licheniformis ΔPBSX zeigte aber zwei Akkumulationen über zwei unterschiedlichen Prophagenbereichen, BLi_Pp3 und BLi_Pp6. Um zu klären, ob die ~40 kb Phagen-DNA-Bande mit der starken Prophagensequenzakkumulation am Prophagen BLi_Pp3 zusammenhängt, wurde Prophage BLi_Pp3 aus dem Stamm B. licheniformis ΔPBSX deletiert (siehe Kapitel 3.1.3) und somit der Stamm B. licheniformis ΔPBSX-ΔBLi_Pp3 erstellt.

Der Stamm B. licheniformis ΔPBSX-ΔBLi_Pp3 reagierte bei Behandlung mit Mitomycin C nicht mit Lyse, wie die ihm zugrundeliegenden Stämme DSM13 und MW3 (siehe Abbildung 6). Im Phagenpräparat von B. licheniformis ΔPBSX-ΔBLi_Pp3 konnten mittels TEM (siehe Kapitel 2.6.2) keine Phagenpartikel identifiziert werden. Phagen-DNA aus der genannten Phagenpräparation konnte weder im Agarosegel visualisiert (siehe Abbildung 8) noch deren Konzentration mittels NanoDrop bestimmt werden (siehe Kapitel 2.4.1.6). Daraus ließ sich ableiten, dass der Siphoviridae-ähnlicher Phagenpartikel (siehe Abbildung 7 B) und die ~40 kb Phagen-DNA-Bande (siehe Abbildung 8) mit dem BLi_Pp3 Prophagen assoziiert sind.

Ungeachtet der nicht sichtbaren und nicht messbaren Phagen-DNA wurde diese mittels NGS sequenziert und wie im Kapitel 3.1.7.1 beschrieben untersucht. Die Phagen-DNA-Sequenzen akkumulierten ausschließlich im Bereich des Prophagen BLi_Pp6 (siehe Abbildung 11).Damit konnte neben dem PBSX-ähnlichem BLi_Pp2-Prophagen und dem Siphoviridae-ähnlicher BLi_Pp3-Prophagen, ein dritter phagenpartikelbildender Prophage im B. licheniformis DSM13 nachgewiesen werden.

Abbildung 11: Sequenzverteilung der Phagen-DNA aus B. licheniformis ΔPBSX-ΔBLi_Pp3 Aufgetragen sind NPKM-Werte, generiert mit TraV in kontinuierlichen 1 kb-Fragmenten auf der Sequenzzuordnung der Phagen-DNA, gewonnen aus B. licheniformis ΔPBSX-ΔBLi_Pp3. Die Prophagenbereiche BLi_Pp1 bis BLi_Pp7 sind mit grauen Balken kenntlich gemacht. Prophage BLi_Pp6 weist die höchste Sequenzanhäufung auf. Diese ist nach links und rechts relativ scharf abgegrenzt