Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass bei den verschiedenen Aufschlussverfahren zur Herstellung von Gelatine aus Knochen nicht in jedem Falle mit einer vollständigen Elimination der aus den Knochen stammenden Tetracyclin-Rückstände zu rechnen ist. Allerdings konnten quantitative Unterschiede zwischen den verschiedenen Aufschlussverfahren bezüglich der prozentualen Reduktion der Tetracyclin-Konzentrationen im Ausgangsmaterial festgestellt werden. Nur zwei Verfahren führten zu einer Gelatine, die frei von nachweisbaren Tetracyclin-Rückständen und von guter sensorischer Qualität war, nämlich das alkalische Aufschlussverfahren und das saure Aufschlussverfahren mit 10-tägiger Mazeration. Da beim alkalischen Aufschlussverfahren bereits das Ossein nach Äscherung frei von nachweisbaren Tetracyclin-Rückständen war und die so gewonnene Gelatine die besten sensorischen Eigenschaften aufwies, ist diese Methode nach momentanem Erkenntnisstand als die Methode der Wahl für die Herstellung von Gelatine aus Knochen zu bezeichnen. Diese Methode ist nicht zuletzt wegen der BSE-Problematik heute die fast ausschließlich angewendete Methode zur Herstellung von Gelatine aus Knochen. Zum Teil wird allerdings auch heute noch das saure Aufschlussverfahren angewendet. Wird dieses Verfahren in der ursprünglichen Form angewendet, besteht die Möglichkeit, dass sich im Lebensmittel Gelatine inakzeptable Konzentrationen von Tetracyclinen finden. Daher ist zu empfehlen, dass die Mazeration im sauren Aufschluss-verfahren auf 10 Tage verlängert wird, um die Lebensmittelsicherheit der Gelatine im Hinblick auf Rückstände von Tetracyclinen zu erhöhen.
Eine abschließende Bewertung der verschiedenen Herstellungsverfahren kann zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht geäußert werden, da es im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich war, die industrielle Herstellung vollständig nachzuahmen. Unterschiede zwischen der industriellen und der labormäßigen Gelatineherstellung bestanden in Punkten, die zum Teil eine höhere und zum Teil eine geringere Tetracyclin-Reduktion erwarten lassen. Insbesondere von Bedeutung ist der Prozessschritt der Konzentration der Frischgelatine, welcher bei der labormäßigen Gelatineherstellung unterblieb. Dieser Vorgang bewirkt eine Konzentrierung der Gelatine und damit aller Wahrscheinlichkeit nach auch eine starke Erhöhung der Tetracyclin-Konzentrationen in der an den Endverbraucher abgegebenen Gelatine.
Aber auch die im Rahmen der hier durchgeführten Untersuchungen in der Frischgelatine nachgewiesenen Tetracyclin-Konzentrationen lagen zum großen Teil über den gesetzlich vorgeschriebenen Höchstmengen für Tetracycline in anderen Lebensmitteln tierischen Ursprungs. Die Gefahr hierbei liegt nicht in einer akuten Gesundheitsgefährdung für den Verbraucher, da die akute Toxizität der Tetracycline als gering eingestuft wurde. Als sicherheitsrelevant wurden nur die Auswirkungen der Tetracycline auf die humane Darmflora eingestuft (WHO 1969). Die für die antimikrobielle Wirksamkeit erforderlichen MHK-Werte (MHK: minimale Hemmkonzentration) für veterinärmedizinisch relevante Keime liegen nach KROKER et al. (1996) bei 0,5 bis 2 µg/ml. In den labormäßig hergestellten Gelatineproben fanden sich Konzentrationen von 102,62 bis 1.611,46 µg/kg bzw. 0,51 bis 8,06 µg/ml. Die in der Frischgelatine gefundenen Tetracyclin-Konzentrationen könnten somit antimikrobiell wirksam sein, und es könnte zur Entstehung von Resistenzen kommen. Die Tetracyclin-Resistenz ist weit verbreitet und hat im humanmedizinischen Bereich dazu geführt, dass diese Antibiotika nur noch selten und nur bei bestimmten Indikationen eingesetzt werden (KÖRNER 2000).
Durch die Säurebehandlung im Rahmen der Mazeration kam es zur Entstehung von Anhydro-Tetracyclinen. Dabei stieg die Menge der entstandenen Anhydro-Tetracycline mit Erhöhung der Salzsäure-Konzentration an. Anhydro-Tetracycline sind zum einen wesentlich toxischer als ihre Muttersubstanzen (KLIMOVA u. ERMOLOVA 1976) und induzieren zum anderen trotz geringerer antimikrobieller Aktivität in höherem Maße Resistenzen (BERTRAND et al.
1984). Ihr Vorkommen in Lebensmitteln sollte daher noch kritischer beurteilt werden als das der Muttersubstanzen. Die für Tetracycline festgelegten Rückstandshöchstmengen gelten nur für die Tetracycline sowie ihre Epimere. Aufgrund der toxikologischen Relevanz der Anhydro-Tetracycline sollte jedoch in Betracht gezogen werden, eigene ADI-Werte und in der Folge auch Rückstandshöchstmengen für diese Substanzen zu ermitteln.
Aufgrund der Ergebnisse der hier durchgeführten Untersuchungen kann nicht ausgeschlossen werden, dass die auf dem Markt befindliche Gelatine Tetracyclin-Rückstände enthält. Die gesetzlich vorgeschriebenen Höchstmengen für Tetracycline gelten nur für Leber, Niere Muskulatur, Milch und Eier, nicht jedoch für Gelatine. Es ist daher zu überlegen, auch für dieses Lebensmittel tierischen Ursprungs Höchstmengen für Tetracycline festzulegen. Die Studien zur Festlegung dieser Höchstmengen sowie die anschließende behördliche
Überwachung ihrer Einhaltung stellen einen nicht zu unterschätzenden Verwaltungsaufwand dar. Eine andere Möglichkeit, für ein sicheres Lebensmittel Gelatine im Hinblick auf Rückstände von Tetracyclinen zu sorgen, ist die Einbeziehung dieser Problematik in die geplante Speisegelatine-Verordnung, z.B. in der Form, dass im Anhang das Freisein der verwendeten Rohstoffe von Antibiotika vorgeschrieben wird.
Um den Verbraucher vor einer Kontamination des Lebensmittels Gelatine mit Tetracyclinen zu bewahren, sollte neben einer gesetzlichen Regelung der Rückstandsproblematik und der Anwendung eines zur Tetracyclin-Eliminierung geeigneten Herstellungsverfahrens auch versucht werden, den Eintrag von Tetracyclinen in die Lebensmittelindustrie zu verringern.
Es bestehen zwei Möglichkeiten:
1. Rigorose Einschränkung des Einsatzes von Tetracyclinen in der veterinärmedizinischen Praxis,
2. Kontrolle und Selektion des zur Gelatineherstellung verwendeten Rohmaterials.
Ad 1.: Die Einschränkung bzw. das Verbot des Einsatzes von Tetracyclinen in der veterinärmedizinischen Praxis wird sich aufgrund der positiven Eigenschaften dieser Antibiotika gerade in der Nutztierhaltung nur schwerlich durchsetzen lassen. Genannt sei hier vor allem die relative Kostengünstigkeit im Vergleich zu anderen Breitspektrumantibiotika.
Möglicherweise könnte im Rahmen des Trends zu „Bioprodukten“ die Anwendung von Antibiotika in der Nutztierhaltung reduziert werden. Nach den Vorgaben der Ergänzungsverordnung zur Tierproduktion (VO (EG) 1804/99), im Rahmen der bestehenden Verordnung über den ökologischen Landbau (VO (EWG) 2092/91), sind in Biobetrieben zur Behandlung erkrankter Tiere physiotherapeutische, homöo-pathische und andere natürliche Mittel vorzuziehen. Erst bei Versagen dieser Behandlung dürfen in Verantwortung eines Tierarztes chemisch-synthetische Substanzen und/oder Antibiotika verabreicht werden (RAMMELMAYR 2000).
Weiterhin könnte unter Umständen der Einsatz von Antibiotika in der Nutztierhaltung in Zukunft aufgrund der Beachtung der „Leitlinien zum Antibiotikaeinsatz“ reduziert werden. Die Beachtung dieser Leitlinien wird im geplanten Tierarzneimittel-Neuordnungsgesetz explizit gefordert (MROZEK 2001).
Ad 2.: Die Kontrolle und Selektion der in der Gelatinefabrik angelieferten Frischknochen ist mit geringem Zeit- und Kostenaufwand möglich. Wie bereits erläutert stellt die Methode des Screenings mit der UV-Lampe ein zuverlässiges Verfahren dar, Tetracyclin-positive Knochen zu identifizieren, die dann aus dem Produktionsprozess entfernt werden könnten.
Das größere und nicht zu behebende Problem stellt der möglicherweise entstehende Rohstoffengpass dar. Aufgrund der Tatsache, dass sich selbst unter den als tauglich beurteilten Tierkörpern nur wenige befinden, deren Knochen nicht mit Tetracyclin-Rückständen belastet sind, bleibt eine zu geringe Menge Rohmaterial, das sich für die Herstellung von Gelatine eignet.
Die Untersuchung der Eigenkontrollproben der Gelatineindustrie und der gelatinehaltigen Handelsprodukte aus dem Lebensmittel- und Arzneimittelbereich ergab in keinem Fall einen positiven Rückstandsbefund in der Gelatine. Für eine Einschätzung der auf dem Markt befindlichen Gelatine müssten jedoch in wesentlich größerem Umfang Proben genommen und untersucht werden.
Die Gelatineindustrie sollte daher die Tetracyclin-Problematik auch in Zukunft nicht außer acht lassen. Um ein hundertprozentig sicheres Lebensmittel an den Verbraucher abzugeben, sollte zusätzlich zur Anwendung eines zur Tetracyclin-Eliminierung geeigneten Herstellungsverfahrens jede Charge der produzierten Gelatine auf Tetracyclin-Rückstände untersucht werden. Damit ist ein erheblicher Kostenaufwand verbunden, der nicht nur durch die Untersuchung selbst, sondern auch durch die erforderliche Lagerung der Produkte bis zum Eintreffen der Untersuchungsergebnisse verursacht wird. Die Kosten dürfen aber bei einer für die Sicherheit von Lebensmitteln getroffenen Entscheidung nicht die maßgebliche Rolle spielen.
6 Zusammenfassung
Es ist bekannt, dass die Knochen geschlachteter Tiere häufig mit Tetracyclinen belastet sind.
Da Knochen als Rohstoffe für die Herstellung von Gelatine eingesetzt werden, sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit geklärt werden, ob das Lebensmittel Gelatine als sicher im Hinblick auf Rückstände von Tetracyclinen gelten kann. Dazu wurden verschiedene Aufschlussverfahren zur Herstellung von Gelatine aus Knochen im Labormaßstab durchgeführt und auf ihre Eignung überprüft, Tetracyclin-Rückstände im Ausgangsmaterial zu eliminieren. Es wurden in diesem Zusammenhang auch Eigenkontrollproben der industriellen Gelatineherstellung sowie gelatinehaltige Handelsproben aus dem Lebensmittel-und Arzneimittelbereich auf Tetracyclin-Rückstände untersucht. Dazu musste zunächst ein Verfahren entwickelt werden, welches eine Tetracyclin-Extraktion aus gelatinehaltigen Proben zur Aufbereitung für die HPLC-Untersuchung ermöglicht.
Zur labormäßigen Gelatineherstellung wurden stark Tetracyclin-belastete Schweineknochen verwendet. Durchgeführt wurde die Gelatineherstellung mit folgenden Aufschlussverfahren:
Alkalisches Aufschlussverfahren: hier erfolgte zusätzlich zur 7-tägigen Mazeration mit einer Salzsäure-Endkonzentration von 5 % ein 46-tägiges Kalkmilchbad,
Saures Aufschlussverfahren: bei diesem Verfahren unterblieb das Kalkmilchbad,
Saures Aufschlussverfahren mit Variationen der Mazeration: in einer Versuchsreihe wurde die Dauer der Mazeration auf 10 bzw. 14 Tage erhöht, in einer anderen Versuchsreihe wurde die Salzsäure-Endkonzentration erhöht auf 7,5 bzw. 10 %,
Handwerkliche Methode: bei diesem Verfahren wurden die gereinigten Knochen lediglich ausgekocht.
Bei allen Verfahren wurde die gewonnene Gelatine sensorisch untersucht. Weiterhin wurden Proben des Ausgangsmaterials (Knochen), des Zwischenproduktes (Ossein) und des End-produktes (Gelatine) mittels HPLC auf ein Vorhandensein von Tetracyclin-Rückständen untersucht.
Zur Extraktion der Tetracycline aus der Matrix wurde bei Knochen- und Osseinproben Salzsäure, bei Gelatineproben eine Pepsinlösung eingesetzt.
Aus den ermittelten Tetracyclin-Konzentrationen in den verschiedenen Produktionsstufen wurde die jeweilige prozentuale Tetracyclin-Reduktion berechnet, zu der das Herstellungsverfahren geführt hat. Der statistische Vergleich der Reduktionswerte aller Methoden ergab folgende Rangliste, beginnend mit der stärksten Reduktion.
Platz 1: Alkalisches Aufschlussverfahren
Platz 2: Saures Aufschlussverfahren mit 14-tägiger Mazeration Platz 3: Saures Aufschlussverfahren mit 10-tägiger Mazeration Platz 4: Handwerkliche Methode
Platz 5: Saures Aufschlussverfahren mit einer Salzsäure-Endkonzentration von 7,5 % Platz 6: Saures Aufschlussverfahren (Mazeration 7 Tage, Salzsäure-Endkonzentration 5 %) Platz 7: Saures Aufschlussverfahren mit einer Salzsäure-Endkonzentration von 10 % Zu einer Absenkung der ursprünglichen Tetracyclin-Konzentration unter die HPLC-Nachweisgrenze hat lediglich das alkalische Aufschlussverfahren sowie das saure Aufschlussverfahren mit verlängerter Mazeration geführt, wobei die sensorische Beschaffenheit der Gelatine beim sauren Aufschlussverfahren mit 14-tägiger Mazeration als inakzeptabel beurteilt wurde.
Von besonderer Bedeutung ist die bei den eigenen Untersuchungen festgestellte Entstehung von Anhydro-Tetracyclinen durch die Säurebehandlung im Rahmen der Mazeration. Die Menge der entstandenen Anhydro-Tetracycline stieg mit Erhöhung der Salzsäure-Konzentration an. Aufgrund ihrer toxikologischen Eigenschaften sind die Anhydro-Tetracycline bezüglich einer Gesundheitsgefährdung für den Verbraucher wesentlich kritischer zu beurteilen als ihre Muttersubstanzen.
Die Untersuchung der Eigenkontrollproben aus der industriellen Gelatine-Herstellung ergab nur beim Ausgangsmaterial positive Rückstandsbefunde, Ossein- und Gelatineproben erwiesen sich ebenso wie die untersuchten Handelsproben aus dem Lebensmittel- und Arzneimittelbereich als frei von nachweisbaren Tetracyclin-Rückständen.
Schlussfolgerungen:
Das Verfahren zur Gelatineherstellung aus Knochen, das heute in der Industrie fast ausschließlich angewendet wird, ist das alkalische Aufschlussverfahren. Die vorliegenden Untersuchungen ergaben deutliche Hinweise darauf, dass dieses Verfahren auch das signifikant beste im Hinblick auf Rückstände von Tetracyclinen in der Gelatine darstellt.
Wird ausnahmsweise das saure Aufschlussverfahren angewandt, sollte die Dauer der Mazeration auf 10 Tage erhöht werden, um Risiken einer Tetracyclin-Belastung der gewonnenen Gelatine zu minimieren.
Sinnvoll erscheint auch eine deutliche Reduzierung des Eintrages von Tetracyclinen in die Nahrungsmittelkette, z.B. durch eine restriktive Anwendung dieser Substanzen bei lebensmittelliefernden Tieren.
7 Summary
Elke Weidenberg
Comparison of different production processes of gelatin derived from bones with regard to residues of tetracyclines
Tetracycline residues are frequently to be found in bones of slaughtered animals. As bones are used as raw material for the manufacturing of gelatin, the aim of the present study was to investigate whether the production of gelatin from bones is safe with regard to residues of tetracyclines. Different production processes of gelatin from bones were performed in a laboratory scale and studied for their effectivity of elimination of tetracycline residues.
Additionally self-control samples of the gelatin industry and gelatin containing market products from the fields of food and medicine were also investigated for tetracycline residues.
Another aim of the study was to develop a method suitable for the extraction of tetracyclines from gelatin.
Pig bones contaminated with tetracyclines were used for the gelatin manufacturing in the laboratory. The manufacturing of gelatin was performed under different conditions:
Alkaline process: in addition to an acidulation of 7 days (with a final concentration of the hydrochloric acid of 5 %) an alkaline treatment of 46 days using lime was carried out, Acid process: using this procedure the alkaline treatment remained undone,
Acid process with variations of the acidulation: in one experiment the duration of the acidulation process was extended to 10 respectively 14 days, in another experiment the final concentration of the hydrochloric acid was changed to 7.5 and 10 %, respectively, Traditional method: the cleaned bones were just cooked in boiling water.
At the end of every production process the gelatin was examined for sensory properties.
Further, samples of the raw material (bones), of the intermediate product (ossein) and of the final product (gelatin) were examined for tetracycline residues using HPLC.
The extraction of the tetracyclines from bones and ossein was performed with hydrochloric acid, while for the gelatin samples a pepsin solution was used.
From the tetracycline concentrations measured in the samples during the different production steps a percentage of tetracycline reduction was calculated. The statistical comparison of the percentage decreases led to the following ranking list, beginning with the highest rate of reduction.
1st place: Alkaline process
2nd place: Acid process with an acidulation of 14 days 3rd place: Acid process with an acidulation of 10 days 4th place: Traditional method
5th place: Acid process with a final concentration of the hydrochloric acid of 7.5 % 6th place: Acid process (acidulation 7 days, final concentration of hydrochloric acid 5 %) 7th place: Acid process with a final concentration of the hydrochloric acid of 10 %
Only the gelatin produced with the alkaline process and the acid process with an extended acidulation period did not contain any detectable tetracycline residues, but the gelatin produced with the acid process with an acidulation of 14 days was of poor sensory quality.
Another important finding was the degradation of tetracycline to anhydro-tetracycline during the acid treatment. The concentrations of anhydro-tetracylines increased with increasing concentrations of hydrochloric acid. Because of their stronger toxicity compared with the parent substances the detection of anhydro-tetracyclines in ossein and gelatin samples may be of great importance for public health.
From the self-control samples of the gelatin industry only samples of the raw material showed detectable tetracycline residues. Neither ossein and gelatin samples nor the gelatin containing market products contained detectable tetracycline residues.
Conclusions:
The alkaline process for the production of gelatin from bones is the most applied method in the food industry. This investigation resulted in distinct hints for this method to represent also the best method with regard to residues of tetracyclines in the gelatin. If the acid process should be used to manufacture gelatin from bones, the acidulation process should be extended to 10 days to minimize possible risks from a contamination of gelatin with tetracyclines.
The most effective method to avoid potential risks would be a more restricted use of tetracyclines in animal husbandry.
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