Die Aussaat der Pflanzen für das Gewächshausscreening erfolgte in mit Torf gefüllten Pikierschalen (24 x 32 cm), die zur Erhaltung einer hohen Luftfeuchtigkeit mit einer Glasscheibe abgedeckt waren. Nach ca. einer Woche wurden die Sämlinge in Multitopfschalen (51 Töpfe mit Ø 5 cm) pikiert. Das Substrat in den Multitopfschalen bestand aus einer Mischung aus Torf, gedämpftem Kompost und Sand (3:3:1). Hierin wurden die Pflanzen für ca. zwei weitere Wochen kultiviert, bis sich das dritte Laubblatt zeigte. Anschließend wurden sie zur Vernalisation für einen Zeitraum von ca. acht Wochen bei 4°C kultiviert. Nach der Vernalisation wurden die Pflanzen aus den Multitopfplatten in größere Kunststofftöpfe (13 cm x 13 cm x 13 cm) umgetopft. In diesen Töpfen wurden sie bis zur Inokulation bei einer Temperatur von 25±10°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 35 bis 40% im Gewächshaus weiter kultiviert, wobei sie vollständig randomisiert aufgestellt wurden, um etwaige Randeffekte wie z.B. Temperaturunterschiede auszuschließen. Während des gesamten Versuchszeitraums standen sie auf Gewächshaustischen, die mit einem Gießfilz und perforierter Folie ausgelegt waren, so dass die Wasserversorgung von unten sichergestellt war. Die Regelung der Temperatur erfolgte durch Zuschalten der Heizung bzw. durch Öffnen oder Schließen der Dachfenster und Beschattung. Um die Pflanzen möglichst geringem Stress auszusetzen, wurde Wasserstress vermieden und nach Berücksichtigung der vor allem im Kompost vorhandenen Nährstoffe wöchentlich nach Bedarf mit Hakaphos (15% N; 15% K2O; 11% P2O5; 1% MgO) sowie Bittersalz (16% MgO; 13% S) gedüngt. Um den Befall mit Insekten oder pilzlichen Pathogenen zu vermeiden, wurde regelmäßig Netzschwefel gegen Echten Mehltau (Erysiphe chicoracearum DC), Rody (Fenpropathrin) in Kombination mit Paraffinöl gegen die Weiße Fliege (Trialeurodes vaporariorum (West.)) und Tamaron (Methamidophos) gegen Thripse (Thrips tabaci (Lindeman)) appliziert.
Unabhängig von der Jahreszeit und der von außen einfallenden Strahlung wurde durch Kunstlicht eine mindestens sechzehnstündige Photoperiode mit einer mindest Beleuchtungsstärke von 10.000 Lux gewährleistet.
Unter diesen Bedingungen wurden die Pflanzen kultiviert bis sie das Stadium der Vollblüte (BBCH 65) erreicht hatten. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Inokulation durchgeführt, indem ein myzelüberwachsener Agarplug (Ø 7 mm) in eine Blattachsel gelegt und mit Parafilm (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, USA) fixiert
wurde. Die Agarplugs wurden vom Rand eines noch wachsenden Myzels von einer drei Tage alten PDA Platte ausgestochen. Auf diese Weise war sichergestellt, dass stets vergleichbares Inokulum verwendet wurde. Bei der Inokulation wurde darauf geachtet, dass die myzelüberwachsene Seite des Plugs in direktem Kontakt zum Stängel war und dass das Blatt, wie auf Abb. 1 zu erkennen, durch den Parafilm ein wenig nach oben gedrückt allerdings nicht verletzt wurde, um möglichst engen Kontakt des Plugs zur Pflanze zu gewährleisten. Außerdem sollte durch das dichte Umwickeln der Inokulationsstelle mit Parafilm sichergestellt werden, dass der Plug und damit der Pilz nicht austrocknet bevor es zu einer Infektion kommen konnte.
Nach drei Tagen wurde der Parafilm wieder entfernt, um die Länge der entstandenen Läsion messen zu können, sofern die Läsion nicht bereits größer war als die vom Parafilm abgedeckte Fläche. Die Messung wurde stets auf der Seite des Stängels mit der größten Läsionslänge in vertikaler Richtung durchgeführt. Um aus den Daten den AUDPC-Wert errechnen zu können wurde die Länge der Läsion täglich über einen Zeitraum von sieben Tagen nach entfernen des Parafilms, von 3 dpi bis 9 dpi, festgehalten. Der AUDPC-Wert wurde nach folgender Formel (Kaiser 2007) berechnet:
Wobei die Läsionslänge zum Zeitpunkt i und die Anzahl der Tage nach der Inokulation ist.
Da der Inokulationstermin von dem Entwicklungsstadium der Pflanze abhängig gemacht wurde und die Entwicklung sich zwischen verschiedenen Genotypen, aber auch zwischen Pflanzen eines Genotyps, unterschied wurde über einen längeren Zeitraum hinweg täglich kontrolliert, ob Pflanzen inokuliert werden mussten.
Außerdem wurde die Temperatur beim Zeitpunkt der Inokulation berücksichtigt und an extrem warmen Tagen fand keine Inokulation statt.
Die Anzahl der Wiederholungen betrug in dem Gewächshausscreening, in dem die Genotypen aus dem Feldversuch getestet wurden, 12 und in dem Gewächshausscreening, in dem die wilden Brassica Arten eingesetzt wurden, 11.
Da einige der wilden Brassica Arten, die im Gewächshausscreening eingesetzt wurden, keinen Spross bildeten oder blühten, wurden diese Pflanzen im Winter
2009/10 ein weiteres Mal vernalisiert. Für ca. vier Wochen wurden sie in eine offene Vegetationshalle gestellt, in der zu diesem Zeitpunkt Temperaturen zwischen 0 und 5°C herrschten. Im Anschluss daran wurden sie wiederum in das Gewächshaus gebracht, um die Spross und Blütenentwicklung zu ermöglichen. Pflanzen, die während dieser Zeit erfroren oder keine Sprosse oder Blüten entwickelten, konnten nicht inokuliert und somit in den Versuch mit einbezogen werden. Da sich der Versuch über einen längeren Zeitraum hinzog, wurde auch die Temperatur im Gewächshaus mittels Data Logger (Voltcraft® DL-120 TH, Conrad Electronic GmbH, Hirschau) aufgezeichnet, so dass die Temperatur zum Zeitpunkt der Inokulation mit in die Betrachtung einbezogen werden konnte. Pflanzen, die nach der Inokulation keine Läsion aufwiesen wurden direkt über oder unterhalb des ersten Inokulationsversuches erneut Inokuliert bis sich Läsionen entwickelten. Die Zeitpunkte und die Anzahl sämtlicher Inokulationen, auch der nicht erfolgreichen wurden notiert, so dass aus der Anzahl an Inokulationen die nötig waren, um eine Läsion zu erzeugen, die Inokulationseffizienz in Prozent ermittelt werden konnte. Bei dem Gewächshausscreening, in dem die Feldgenotypen verwendet wurden, trat diese Phänomen nicht auf. Die Inokulationseffizienz wurde nach folgender Formel berechnete:
Dabei ist #Läsionen die Anzahl der zu beobachtenden Läsionen und #Inokulationen die Anzahl der Inokulationen, die nötig waren, um die Läsionen zu erzeugen.
In dem Experiment, in dem die wilden Brassica Arten und Resynthesen eingesetzt wurden, wurde zusätzlich zum Zeitpunkt der Inokulation direkt an der zu inokulierenden Stelle der Stängeldurchmesser bestimmt. Weitere morphologische Merkmale wie z.B. Blütenfarbe (gelb/weiß), Blütengröße (groß/klein), Blütenzahl (viele/wenige), Verzweigung (stark/gering), Blattform, Behaarung (stark/gering), Dicke der Wachsschicht (stark/gering), Stängelfarbe (grün/rot) sowie die Größe zum Zeitpunkt der Inokulation (cm) wurden ebenfalls visuell erfasst. Außerdem wurde nach der letzten Läsionslängenmessung die Läsion entfernt und das Frisch- sowie Trockengewicht des Stängels direkt unterhalb der Läsion bestimmt.
Abb. 1: Im Gewächshaus durchgeführte Inokulation mittels Agar-Myzelplugs und daraus resultierende Läsion.