Die Samen der Pflanzen für den Oxalsäuretest wurden, wie vorangegangen für die Pflanzen für das Gewächshausscreening beschrieben, in Pikierschalen ausgelegt.
Sie wurden ebenfalls in Multitopfplatten mit der oben beschriebenen Substratmischung pikiert, allerdings nicht vernalisiert oder umgetopft. Diese Pflanzen wurden in einem Klimaraum, der sich durch extrem konstante Temperatur und Luftfeuchtigkeit auszeichnete, bei einer konstanten Temperatur von 20°C kultiviert.
Die Photoperiode und Beleuchtungsstärke entsprach den oben genannten Bedingungen, wobei berücksichtigt werden muss, dass keine von außen einfallende Strahlung vorhanden war. Durch die Anzucht unter diesen sehr standardisierten Bedingungen sollte sichergestellt werden, dass stets vergleichbares Pflanzenmaterial im Oxalsäuretest eingesetzt wird. Die Bewässerung erfolgte über ein Gießflies von unten, um Wasserstress zu vermeiden. Unter diesen Bedingungen wurden die Pflanzen für ca. vier Wochen angezogen, bis das fünfte Laubblatt voll entwickelt war.
Auf die Gabe von Düngern wurde verzichtet, um Unterschiede in der Nährstoffversorgung der Pflanzen zu vermeiden. Am Tag vor dem Oxalsäuretest wurden die Pflanzen unabhängig von der Feuchtigkeit des Substrats gründlich
gegossen, um sicherzustellen, dass die Wasserversorgung zum Zeitpunkt des Tests zwischen allen Pflanzen identisch war.
Auf Pflanzenschutzmaßnahmen wurde vollständig verzichtet, um eine Beeinflussung der Messergebnisse durch etwaige Rückstände der Spritzbrühe zu vermeiden.
Sofern die Pflanzen von Schädlingen oder Pathogenen befallen waren, wurden sie verworfen und nicht für den Test benutzt. Um stets Pflanzen im gleichen Entwicklungsstadium zur Verfügung zu haben, wurden in regelmäßigen Abständen erneut Pflanzen angezogen.
Zur Vorbereitung des Oxalsäuretests wurden 24-Well-Mikrotiterplatten (Ø der Vertiefung 1,6 cm) am Vortag gründlich mit bidest. Wasser gespült und die Leitfähigkeit in den einzelnen Wells mittels eines Leitfähigkeitsmesser (Fa.:
Radiometer Kopenhagen, Typ CDM 2e) überprüft. Sofern diese Messung ergab, dass die Platten sauber waren, wurden sie über Nacht getrocknet. Alle Geräte und Gefäße wurden gründlich mit bidest. Wasser gespült. Am Tag des Tests wurden die 24-Well-Mikrotiterplatten mit 2 ml bidest. Wasser, 1 und 2 mM, am Vortag angesetzter, Oxalsäure befüllt.
Für den eigentlichen Test wurde jeweils das fünfte voll entwickelte Laubblatt verwendet, das direkt vor dem Ansetzen des Tests von der Pflanze entnommen wurde. Hieraus wurden mit einem scharfen Korkbohrer rechts und links der Mittelrippe Blattscheiben (Ø 1,3 cm) ausgestanzt. Je Konzentration wurden sechs Blattscheiben verwendet, die von unterschiedlichen Pflanzen stammten. Da das Blattmaterial der eingesetzten wilden Brassica-Arten bzw. Resynthesen recht inhomogen war, wurde in diesem Versuch zusätzlich das Gewicht der Blattscheiben bestimmt. Diese wurden dann in die vorbereiteten Vertiefungen mit unterschiedlichen Oxalsäurekonzentrationen überführt. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Blattscheiben mit der Oberseite nach oben in der Lösung schwammen und sich keine Luftblasen unter den Blattscheiben bildeten, um einen gleichmäßigen Kontakt mit den Lösungen sicherzustellen. Die so vorbereiteten 24-Well-Mikrotiterplatten wurden zur Inkubation für zwei Stunden bei 20°C und Kunstlicht in einem biologischem Klimaschrank (WB 750 KFL, Mytron, Heiligenstadt) aufbewahrt. Nach dieser Inkubation wurde die Oxalsäure vollständig aus den Vertiefungen entfernt und jede Vertiefung mit der darin befindlichen Blattscheibe zweimal mit jeweils 2 ml bidest.
Wasser gespült, um möglichst viel Oxalsäure zu entfernen. Nach dem Spülen
wurden erneut 2 ml bidest. Wasser zugegeben und die Leitfähigkeit in µS mit einem Leitfähigkeitsmesser zu Versuchsbeginn bestimmt, indem das bidest. Wasser zwischen die Elektroden gesaugt und nach der Messung wieder in das Well zurückgegeben wurde (siehe Abb. 2). Hierbei wurde wiederum darauf geachtet, dass die Blattscheiben mit der Oberseite nach oben in der Lösung schwammen und sich keine Luftblasen unter den Scheiben bildeten. Außerdem wurde während des Spülens und den sich anschließenden Messungen vermieden die Blattscheiben direkt zu berühren um Verletzungen des Gewebes zu vermeiden.
In Vertiefungen, bei denen der erste Messwert 3,5 µS überschritt, wurde erneut gespült, da nicht die gesamte Oxalsäure entfernt wurde und die verbleibende Oxalsäure weiteren Schaden am Blattgewebe hervorrufen könnte.
Von diesem Zeitpunkt an wurden nach 1, 2, 3, 4, 5 und 24 Stunden Messungen der Leitfähigkeit des bidest. Wassers in den Wells durchgeführt, wobei jedes Mal das Wasser wieder zurück ins Well gegeben wurde, um es nach einer Stunde erneut messen zu können. Zwischen den Messungen wurden die Platten stets bei 20°C und einem Tag/Nachtzyklus von 16/8 h inkubiert. Hierbei dienten die Messungen nach 1, 2, 3, 4 und 5 Stunden lediglich als interne Kontrolle. Sofern eine Vertiefung nicht ausreichend gespült wurde oder eine Blattscheibe durch das Spülen oder Messen verletzt wurde, konnte dies an den frühen Messterminen erkannt werden und diese Blattscheiben wurden dann nicht mit in die Betrachtung einbezogen. Um die Inhomogenität des Blattmaterials der wilden Brassica-Arten und Resynthesen zu berücksichtigen, wurde außerdem das Frisch- und Trockengewicht der Blätter, die Anzahl der Spaltöffnungen je mm² und der Grad der Behaarung bestimmt. Diese Daten sollten später als Korrekturfaktoren mit in die Berechnung einbezogen werden.
Die Änderung der Leitfähigkeit wurde um die Änderung der Leitfähigkeit in der Wasservariante nach folgender Formel korrigiert:
Wobei die Änderung der Leitfähigkeit korrigiert um die Änderung der Leitfähigkeit in der Wasservariante, der Messwert der 2 mM Variante zum Zeitpunkt 24 h, der Mittelwert der 2 mM Variante zum Zeitpunkt 0 h, der Mittelwert der 0 mM Variante zum Zeitpunkt 24 h und der Mittelwert der 0 mM Variante zum Zeitpunkt 0 h ist.
Abb. 2: Messung der Leitfähigkeit nach der Inkubation der Blattscheiben in Oxalsäure.