Relative Kopienzahlbestimmung an genomischer DNA der verschiedenen Founder (F0) und ausgewählter Verpaarungen

Für die weitere Zucht der NS1-, NS2- und NS3-Founder sollten drei Mäuse eingesetzt werden, deren Transgen-Kopienzahl im Genom im hohen, mittleren und unteren Bereich liegt. Um zu überprüfen, welche Kopienzahlen der Konstrukte im Genom der Founder vorlagen, wurde eine relative Kopienzahlbestimmung durchgeführt (2.2.5.4).

In Abbildung 3.28 sind die Kopienzahlbestimmungen für die jeweiligen NS1, NS2 und NS3-Founder gezeigt.

In Tabelle 3.4 sind die ausgewählten Linien und ihre relative Kopienzahl aufgelistet.

A.

30w 51m 52w 53m 57m 58m 60w 61w 62w 64m 66w 67w

Mäuse

relative Kopienzahl

Abb. 3.28: Relative Kopienzahlbestimmung der NS1-, NS2- und NS3-Founder. Um zu überprüfen, wie viele Kopien der NS1-, NS2-, NS3-Konstrukte in das Genom der jeweiligen Founder integriert sind, wurde eine relative Kopienzahlbestimmung durchgeführt. Die Kopienzahlen wurden miteinander in Relation gesetzt, um bestimmen zu können, welche der Founder für die weitere Verpaarung mit FVB-Mäusen eingesetzt werden sollten. A. –C. Gezeigt ist die relative Kopienzahl von NS1 (A.), NS2 (B.) und NS3 (C.) im Genom

Bemerkung NS1 NS2 NS3

höchste Kopienzahl 21 40 58, 66 mittlere Kopienzahl 16 30 30, 53 tiefste Kopienzahl 11 25 64, 57

Tab. 3.4: Übersicht der relativen Kopienzahlen der ausgewählten Founder von NS1, NS2 und NS3.

3.4.6 Bestimmung der Zahl der Integrationen der NS1-, NS2- und NS3-Konstrukte im Genom durch Taqman- und Southern Blot-Analyse

Für die weitere Zucht sollten die Linien weiter verwendet werden, die nur eine Integration des Konstrukts im Genom haben. Die Integrationszahlbestimmung wurde mit zwei unabhängigen Methoden, der Taqman- und der Southern Blot-Analyse, durchgeführt. Es wurden fünf Nachkommen der F1-Generation, bei denen das NS1-, NS2- oder NS3-Konstrukt mittels PCR nachgewiesen wurde, zusammen mit den jeweiligen Foundern durch Taqman-Analyse (2.2.5.4) überprüft. Die Kopienzahl der Founder wurde anschließend mit der Kopienzahl der fünf Nachkommen verglichen. Wenn eine einzige Integration des Konstrukts im Genom vorhanden ist, wird eine gleiche Kopienzahl sowohl der Founder als auch der Nachkommen erwartet.

In Abbildung 3.29 A ist die relative Kopienzahl der Linien NS1#16 und NS1#21 dargestellt.

Bei der Linie NS1#11, die mit relativer niedriger Kopienzahl ausgewählt wurde, wurde keine Transmission festgestellt und daher keine weitere Analyse durchgeführt. Die Linien NS1#16,

#21 und NS2#25 zeigen eine gleiche Kopienzahl zwischen Founder und Nachkommen, haben also eine einzige Integration des Konstrukts im Genom. Bei der Linie NS2#40 wurden unterschiedliche Kopienzahlen zwischen Founder und Nachkommen gemessen. NS2#40 zeigt zwei oder drei Integrationen des NS2-Konstrukts im Genom (Abb. 3.29 B.). Bei der NS2#30-Linie wurde keine Kopienzahlbestimmung aufgrund der Abwesenheit der Expression des NS2-Konstrukts (Abb. 3.31 A.) durchgeführt. Die Bestimmungen der Kopienzahl bei

NS3#30, NS3#58, NS3#64, NS3#53 und NS3#66 sind in Abbildung 3.29 C zusammengefaßt.

Bei den Linien NS3#30 und NS3#58 wurden unterschiedliche Kopienzahlen zwischen Foundern und deren Nachkommen gemessen. Diese zwei Linien besitzen zwei oder drei Integrationen des NS3-Konstrukts im Genom. Sowohl NS3#64 als auch NS3#53 und NS3#66 zeigen eine gleiche Kopienzahl beim jeweiligen Founder und dessen Nachkommen.

A.

NS3 #64

Abb. 3.29: Relative Kopienzahlbestimmung der NS1-, NS2- und NS3-Founder mit jeweils fünf Nachkommen. A. Gezeigt sind die relative Kopienzahlbestimmung der Linien NS1#16 und NS1#21 mit jeweils fünf Nachkommen. Die relative Kopienzahl ist gleichmäßig sowohl für NS1#16 als auch für NS1#21, und beide Linien besitzen daher je eine Integration. B. Dargestellt sind die relativen Kopienzahlbestimmungen der Linien NS2#25 und NS2#40 mit je fünf Nachkommen. Die Kopienzahlbestimmung der NS2#25 zeigt eine Gleichmäßigkeit, aber bei den Nachkommen der Linie NS2#40 wurden verschiedene Kopienzahlen pro Nachkommen gemessen. C. Gezeigt sind die relativen Kopienzahlen der verschiedenen Linien von NS3.

Unterschiedliche Kopienzahlen wurden bei den Nachkommen der Linien NS3#30 und NS3#58 festgestellt. Die Nachkommen der Linie NS3#64 und die Embryonen der Linien NS3#53 und NS3#66 zeigen ähnliche Kopienzahlen.

Um die Zahl der Integrationen zu bestimmen, wurde parallel zur Taqman-Analyse eine Southern Blot-Analyse bei den verschiedenen Linien durchgeführt. Bei dem in Abbildung 3.30 A dargestellten Southern Blot-Analyse wurde genomische DNA der transgenen Mäuse und von Kontroll-FVB-Mäusen mit der Restriktionsendonuklease KpnI geschnitten. Die geschnittene DNA wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt und, wie unter Abschnitt 2.2.4.1 beschrieben, auf eine Membran übertragen. Die verwendete Sonde wurde mit den Restriktionsenzymen BglI/PstI aus WT-PTP11-cDNA-pCRTOPO isoliert. Die radioaktive

Markierung und anschließende Hybridisierung mit der auf der Membran fixierten DNA erfolgte wie unter 2.2.5 beschrieben.

Bei der Kontroll-FVB-Maus wurde auf dem Autoradiographie-Film keine Bande aufgrund der Spezifität der Sonde für die humane PTPN11-cDNA erwartet. Bei den transgenen Mäusen werden zwei Banden pro Integration erwartet, wodurch neben der 5,7 kb großen Konstrukt-Bande eine weitere Konstrukt-Bande pro Integration entstehen sollte. Die Größe der Nebenbanden hängt von der Entfernung der nächsten 3’ gelegenen KpnI-Schnittstelle zum integrierten Konstrukt ab (Abb. 3.30 A.). Falls eine transgene Linie mehr als eine Integration des Konstrukts im Genom besitzt, werden bei der Southern Blot-Analyse mehr als zwei Banden erhalten, wobei die 5,7 kb große Bande ein besonders starkes Signal geben sollte. In Abbildung 3.30 B, C und D sind die Southern Blot-Analysen für die verschiedenen Linien der NS1-, NS2- und NS3-Konstrukte dargestellt. Die Entwicklung der Autoradiographie-Filme zeigte nur die 5,7 kb großen Bande. Die erwarteten weiteren Banden wurde ganz schwach bei NS2#40 und NS3#58 beobachtet oder nicht detektiert. Diese Banden könnten zu groß sein, um mit einer guten Effizienz auf die Membran übertragen worden zu sein.

Bei den Linien NS1#16, NS1#21 (Abb. 3.30 B.), NS2#25 (Abb. 3.30 C.) und NS3#64 (Abb.

3.30 D.) zeigen sowohl Founder als auch die jeweils fünf Nachkommen die gleiche Intensität der 5,7 kb großen Bande (Abb. 3.30 A.). Im Falle von NS2#40 (Abb. 3.30 C.), NS3#30 und NS3#58 (Abb. 3.30 D.) zeigt die 5,7 kb große Bande mehr oder weniger intensive Signalstärken, je nachdem wie viele Kopien pro Integration im Genom vorhanden sind. Diese Ergebnisse bestätigen die Integrationszahlbestimmungen mittels Taqman-Analyse.

Bei NS2#40 wurden die zwei Integrationen durch Verpaarung von F1-Tieren mit FVB-Tieren voneinander getrennt. Daraufhin entstanden die Linien NS2#401 und NS2#402. Die NS3-Linien, die mehr als eine Integration besitzen, wurden nicht weiter verwendet (NS3#30 und NS3#58). Es wurde daher eine Integrationsbestimmung von NS3#53, NS3#57 und NS3#66-Founder durchgeführt. Diese NS3#66-Founder wurden mit je zwei weiblichen WT-FVB-Mäusen verpaart und anschließend die Embryonen einer schwangeren Maus präpariert, um die Integrationszahl zu bestimmen. Für NS3#53 und NS3#66 wurde nur eine Taqman-Analyse durchgeführt (siehe oben 3.4.6). NS3#57 hatte nicht transmittiert und wurde deshalb nicht weiter verwendet.

5‘ 3‘

5,7kb

KpnI KpnI KpnI KpnI KpnI

5,7kb >3,5kb

1Kopie 1Kopie 1Kopie

PromotorcDNA 3‘UTRPromotor cDNA 3‘UTRPromotorcDNA 3‘UTR

Sonde Sonde Sonde

A.

#16 3m 9w 11m 14m 15w FVB #21 1m 2m 3m 13m 18w FVB

5,7kb

5,7kb

B.

#25 1m 2m 6w 7m 9m FVB #40 1m 3m 4w 10w 11w FVB

5,7kb 5,7kb

C.

D.

#58 1w 2w 3w 13m 18m FVB

#30 3m 6m 9w 12m 17w FVB

5,7kb 5,7kb

#64 1m 3m 8w 9w 10w FVB

5,7kb

Abb. 3.30: Southern Blot-Analyse zur Integrationszahlbestimmung der NS1-, NS2- und NS3-Konstrukte im Genom. A. Dargestellt ist ein Abschnitt der Integration des Konstrukts im Genom mit den KpnI-Schnittstellen sowie der verwendeten Sonde und den erwarteten Größen der Banden bei der Southern Blot-Analyse. B. C. D. Ergebnisse der Southern Blot-Analysen mit dem Enzym KpnI und genomischer DNA der Founder und der jeweils fünf Nachkommen von NS1#16 und NS1#21 (B.), NS2#25 und NS2#40 (C.), NS3#30 NS3#58 und NS#64 (D.) und genomischer DNA von WT-FVB als Negativkontrolle. Die Entwicklung der Autoradiographie-Filme der NS1#16, NS1#21 (B.), NS2#25 (C.) und NS3#63 (D.) zeigten die 5,7 kb große Bande bei der DNA der transgenen Mäusen, jedoch keine Bande bei der DNA der FVB-Maus. Bei NS2#40 (C.), NS3#30 und NS3#58 (D.) trat die 5,7kb-Bande in verschiedenen Intensitäten auf, und eine schwache Nebenbande wurde detektiert.